2. Hóa chất, thiết bị
3.1. Kết quả xây dựng quy trình phát hiện Microsporidia bằng kỹ thuật PCR và
PCR và Realtime PCR
Để khuếch đại trình tự đoạn gen tiểu phần nhỏ small-subunit (SSU) rRNA của Microsporidia, chúng tôi sử dụng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi MF1&MF2 đã được Spencer D.Polly và cs công bố năm 2011. Cặp mồi này có khả năng khuếch đại trình tự ADN đích từ các chủng Microsporidia nuôi cấy như: Encephalitozoon intestinalis, Encephalitozoon hellem và bào tử của chủng
Encephalitozoon cuniculi. Sử dụng kỹ thuật khuếch đại gen theo thời gian thực (RealTime PCR) kết hợp SYBR Green, nhóm tác giả đã phân tích nhiệt nóng chảy để nhận biết phân biệt bốn chủng Microsporidia: Encephalitozoon bieneusi, Encephalitozoon intestinalis, Encephalitozoon hellem và
Encephalitozoon cuniculi, dựa trên kích thước các đoạn ADN được nhân lên từ bốn chủng tương ứng với 262, 282, 291 và 281 bp. Từ kết quả nghiên cứu này nhóm tác giả khuyến nghị sử dụng cặp mồi MF1&MF2 trong phản ứng PCR/RealTime PCR phát hiện Microsporidia trong mẫu bệnh phẩm lâm sàng.
Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại tiểu phần nhỏ RNA ribosomal của Microsporidia.
Đường chạy số 1, đối chứng âm; Đường chạy số 2, sản phẩm khuếch đại đoạn gen RNA ribosomal của Microsporidia; Đường chạy số 3, sản phẩm khuếch đại gen β-globulin của người; M, thang chuẩn DNA.
Sử dụng 02 mẫu bệnh phẩm viêm giác mạc đã được xác định dương tính với Microsporidia bằng phương pháp nhuộm soi tại bộ phận Vi sinh, khoa Xét nghiệm tổng hợp, Bệnh viện Mắt Trung ương, chúng tôi tiến hành tách chiết ADN tổng số theo phương pháp đã trình bày ở phần trên và thực hiện phản ứng khuếch đại 02 gen đích: cặp mồi MF1&MF2 trên thực tế khuếch đại trình tự có kích thước khoảng 254 bp đặc trưng cho tiểu phần nhỏ (SSU) rRNA của
Microsporidia, cặp mồi khác khuếch đại gen nội chuẩn của người, β-globulin với kích thước 180 bp.
Kết quả ở hình 3.1 cho thấy sử dụng cặp mồi MF1&MF2 đã khuếch đại đặc hiệu đoạn gen có kích thước khoảng 254 bp. Trong khi đoạn gen có kích thước 180 bp tương ứng đoạn gen nội chuẩn của người β-globulin cũng được khuếch đại thành công.
Hình 3.2. Minh họa kết quả giải trình tự đoạn gen (SSU) rRNA Microsporidia từ bệnh phẩm giác mạc của bệnh nhân KHUYEN.
Để khẳng định chắc chắn đoạn gen được khuếch đại thành công ở trên là của Microsporidia, chúng tôi tiến hành giải trình tự gen trực tiếp sản phẩm PCR ở hình 3.1 sau khi tinh sạch sản phẩm này. Kết quả giải trình tự chúng tôi thu được trình tự đoạn gen có kích thước sau khi phân tích là 212 nucleotide.
Hình 3.3. Kết quả so sánh trực tuyến trình tự đoạn gen từ mẫu Microsporidia_KHUYEN.scf với ngân hàng gen thế giới.
Với trình tự thu được ở trên, chúng tôi tiến hành so sánh trực tuyến với Ngân hàng gen thế giới (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Kết quả ở hình 3.2 cho thấy đoạn gen 212 bp được xác định là tiểu phần nhỏ ribosome (small subunit ribosomal) thuộc chủng Vittaforma corneae LVPEI.BB630F trong ngân hàng gen thế giới, mã đăng kí: KP099416, với độ tương đồng về trình tự gen là 99%.
Chúng tôi tiến hành lập lại quy trình tách chiết ADN, tiến hành phản ứng PCR và giải trình tự thêm 01 mẫu bệnh phẩm dương tính với Microsporidia
(Microsporidia_TIEP), đều cho kết quả phù hợp 100%, khẳng định đoạn gen chúng tôi nhân bản được là tiểu phần nhỏ ribosome của chủng Vittaforma corneae thuộc loài Microsporidia.
Hình 3.4. Kết quả khuếch đại tiểu phần nhỏ RNA ribosomal của Microsporidia bằng phản ứng Realtime PCR.
Sau khi có được kết quả giải trình tự mẫu chuẩn dương Microsporidia, chúng tôi sử dụng cặp mồi MSRT1 và MSRT2 với probe MSRT do nhóm nghiên cứu thiết kế để khuếch đại trình tự đoạn gen tiểu phần nhỏ small-subunit (SSU) rRNA. Kết quả ở Hình 3.4 cho thấy chúng tôi đã khuếch đại thành công trình tự đoạn gen tiểu phần nhỏ small-subunit (SSU) rRNA của Microsporidia
bằng phương pháp Realtime PCR.