2. Hóa chất, thiết bị
2.3.5. Xây dựng quy trình phát hiện Microsporidia bằng phương pháp PCR và
và Realtime PCR
Để khuếch đại trình tự đoạn gen tiểu phần nhỏ small-subunit (SSU) rRNA của Microsporidia, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR sử dụng cặp mồi MF1 và MF2 với thành phần phản ứng và chu trình nhiệt được trình bày trong Bảng 2.2.
Để đánh giá chất lượng của ADN sau khi tách chiết, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR sử dụng cặp mồi Betaglobin F và Betaglobin R với thành phần phản ứng và chu trình nhiệt được trình bày ở Bảng 2.3.
Bảng 2.2. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại trình tự đoạn gen tiểu phần nhỏ small-subunit (SSU) rRNA của Microsporidia sử
dụng cặp mồi MF1&MF2
Thành phần phản ứng Thể tích (µL)
1) 2X MasterMix DreamTaq Promega 12,5
2) Mồi MF1 (10pM) 1,0
3) Mồi MF2 (10pM) 1,0
4) ADN mẫu chuẩn dương 5,0
5) H2O cho PCR 5,5
Tổng thể tích 25,0
94oC, 2 phút; 38 chu kì [94oC, 30 giây; 57oC, 30 giây; 72oC, 30 giây]; 72oC, 10 phút; giữ nhiệt ở 4oC
Sản phẩm PCR thu được sẽ được tinh sạch sử dụng bộ sinh phẩm GenJET PCR Purification Kit (Thermo) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR:
- Bổ sung tỷ lệ 1V Binding Buffer : 1V sản phẩm PCR cần tinh sạch. Nếu kích thước sản phẩm tinh sạch <500bp thì bổ sung thêm 1V isopropanol.
- Trộn đều hỗn hợp, sau đó chuyển lên cột, ly tâm 11000 vòng/phút trong 1 phút. - Đổ bỏ dịch trong ống thu, bổ sung 700µl dung dịch Wash Solution lên cột, ly tâm 11000 vòng/phút trong 1 phút.
- Đổ bỏ dịch trong ống thu, ly tâm khan 11000 vòng/phút trong 3 phút để loại bỏ hoàn toàn cồn.
- Chuyển cột sang ống thu mới, bổ sung Elution Buffer, ủ ở nhiệt độ thường 2-3 phút, ly tâm 11000 vòng/phút trong 2 phút.
- Bảo quản sản phẩm ỏ -20oC
Sau đó, sản phẩm tinh sạch sẽ được xác định trình tự nucleotide trên hệ thống máy giải trình tự CEQ 8800 sequencer, Beckman Coulter, Mỹ.
Bảng 2.3. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR đánh giá chất lượng ADN sau tách chiết sử dụng cặp mồi Betaglobin F và Betaglobin R
Thành phần phản ứng Thể tích (µL)
1) 2X MasterMix DreamTaq Promega 12,5
2) Mồi BetaglobinF (10pM) 1,0
3) Mồi Betaglobin R (10pM) 1,0
4) ADN mẫu chuẩn dương 5,0
5) H2O cho PCR 5,5
Tổng thể tích 25,0
94oC, 2 phút; 35 chu kì [94oC, 30 giây; 58oC, 30 giây; 72oC, 30 giây]; 72oC, 10 phút; giữ nhiệt ở 4oC
Phản ứng Realtime PCR được sử dụng để khuếch đại trình tự đoạn gen tiểu phần nhỏ small-subunit (SSU) rRNA của Microsporidia được chúng tôi tiến hành với thành phần phản ứng và chu trình nhiệt được trình bày trong Bảng 2.4.
Bảng 2.4. Thành phần và điều kiện phản ứng Realtime PCR khuếch đại trình tự đoạn gen tiểu phần nhỏ small-subunit (SSU) rRNA của
Microsporidia sử dụng cặp mồi MSRT1&MSRT2 và probe MSRT
Thành phần phản ứng Thể tích (µL) 1) 2X MasterMix Qiagen 12,5 2) Mồi MF1 (10pM) 1,0 3) Mồi MF2 (10pM) 1,0 4) Probe MSRT (10pM) 1,0 4) ADN 5,0 5) H2O cho PCR 4,5 Tổng thể tích 25,0
95oC, 15 phút; 45 chu kì [95oC, 15 giây; 60oC,60 giây;]; Kênh màu thu nhận tín hiệu FAM