2. Hóa chất, thiết bị
2.3.5.1. Xác định độ nhạy của phương pháp PCR và Realtime PCR
Mẫu ADN chuẩn dương được tiến hành đo nồng độ ADN ở bước sóng OD260/280 sau đó được tiến hành pha loãng tới nồng độ tới hạn. Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt của phản ứng PCR và Realtime PCR đánh giá độ nhạy của phương pháp được trình bày ở Bảng 2.5 và Bảng 2.6.
Bảng 2.5. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR đánh giá độ nhạy của phương pháp
Thành phần phản ứng Thể tích (µL)
1) 2X MasterMix DreamTaq Promega 12,5
2) Mồi MF1 (10pM) 1,0
3) Mồi MF2 (10pM) 1,0
4) ADN 5,0
5) H2O cho PCR 5,5
Tổng thể tích 25,0
94oC, 2 phút; 35 chu kì [94oC, 30 giây; 57oC, 30 giây; 72oC, 30 giây]; 72oC, 10 phút; giữ nhiệt ở 4oC
Bảng 2.6. Thành phần và điều kiện phản ứng Realtime PCR đánh giá độ nhạy của phương pháp
Thành phần phản ứng Thể tích (µL)
1) 2X MasterMix Qiagen 12,5
2) Mồi MF1 (10pM) 1,0
3) Mồi MF2 (10pM) 1,0
4) Probe MSRT (10pM) 1,0
4) ADN mẫu chuẩn dương 5,0
5) H2O cho PCR 4,5
Tổng thể tích 25,0
95oC, 15 phút; 45 chu kì [95oC, 15 giây; 60oC,60 giây;]; Kênh màu thu nhận tín hiệu FAM
2.3.5.2. Xác định độ đặc hiệu của phương pháp PCR và Realtime PCR
Để xác định độ đặc hiệu của hai phương pháp PCR và Realtime PCR phát hiện Microsporidia, chúng tôi tiến hành chạy trên các mẫu ADN chuẩn dương đối chứng bao gồm: 2 chủng nấm Aspergillus sp, Fusarium sp, 2 chủng vi khuẩn
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus và 2 mẫu bệnh phẩm chẩn đoán dương tính với virusHSV và CMV.
Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt của phản ứng PCR và Realtime PCR đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp được trình bày ở Bảng 2.7 và Bảng 2.8.
Bảng 2.7. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp
Thành phần phản ứng Thể tích (µL)
1) 2X MasterMix DreamTaq Promega 12,5
2) Mồi MF1 (10pM) 1,0
3) Mồi MF2 (10pM) 1,0
4) ADN mẫu chuẩn dương 5,0
5) H2O cho PCR 5,5
Tổng thể tích 25,0
94oC, 2 phút; 38 chu kì [94oC, 30 giây; 57oC, 30 giây; 72oC, 30 giây]; 72oC, 10 phút; giữ nhiệt ở 4oC
Bảng 2.8. Thành phần và điều kiện phản ứng Realtime PCR đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp
Thành phần phản ứng Thể tích (µL)
1) 2X MasterMix Qiagen 12,5
2) Mồi MF1 (10pM) 1,0
3) Mồi MF2 (10pM) 1,0
4) Probe MSRT (10pM) 1,0
4) ADN mẫu chuẩn dương 5,0
5) H2O cho PCR 4,5
Tổng thể tích 25,0
95oC, 15 phút; 45 chu kì [95oC, 15 giây; 60oC,60 giây;]; Kênh màu thu nhận tín hiệu FAM
2.3.5.3. Tạo plasmid chuẩn dương microsporida
Để tiến hành tạo plasmid chuẩn dương Microsporidia dùng trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng bộ sinh phẩm InsTAclone PCR Cloning của Thermo. Quy trình tiến hành được tuân theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Mẫu ADN chuẩn dương sẽ được khuếch đại bằng PCR với thành phần phản ứng và chu trình nhiệt được trình bày ở Bảng 2.9.
Bảng 2.9. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR tạo plasmid chuẩn dương
Thành phần phản ứng Thể tích (µL)
1) 2X MasterMix DreamTaq Promega 12,5
2) Mồi MF1 (10pM) 1,0
3) Mồi MF2 (10pM) 1,0
4) ADN mẫu chuẩn dương 5,0
5) H2O cho PCR 5,5
Tổng thể tích 25,0
94oC, 2 phút; 38 chu kì [94oC, 30 giây; 57oC, 30 giây; 72oC, 30 giây]; 72oC, 25 phút; giữ nhiệt ở 4oC
Sản phẩm PCR sau đó sẽ được tinh sạch bằng bộ sinh phẩm GenJET PCR Purification Kit (Thermo) và được đo nồng độ ADN ở bước sóng OD260/280.
Sau đó, sản phẩm PCR sau tinh sạch sẽ được cloning vào trong vector pTZ57R/T theo quy trình như sau:
Thành phần phản ứng Thể tích 1) Puri pcr MF1&MF2 3µl 2) H2O vô trùng 17µl 3) Vector pTZ57R/T 3µl 4) 5X ligation buffer 6µl 5) Enzyme T4 ligase 1µl Tổng thể tích 30µl
- Chuyển 3µl hỗn hợp phản ứng vào trong tế bào khả biến E. Coli DH5α, ủ trên đá 30 phút.
- Sốc nhiệt 42oC trong vòng 30 giây, sau đó nhanh chóng chuyển lên đá. - Bổ sung 250µl môi trường LB lỏng, lắc 37oC 200 vòng/phút trong 1 giờ. - Trải lên đĩa thạch có sẵn kháng sinh chọn lọc Ampicilin (100µg/ml) và IPTG/Xgal, ủ 37oC qua đêm. Tiến hành chọn lọc khuẩn lạc xanh trắng.
Các khuẩn lạc trắng thu được sẽ được sàng lọc sơ bộ bằng phản ứng PCR- colony với các thành phần được trình bày ở Bảng 2.10.
Bảng 2.10. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR tạo plasmid chuẩn dương
Thành phần phản ứng Thể tích (µL)
1) 2X MasterMix DreamTaq Promega 12,5
2) Mồi M13 F(10pM) 1,0
3) Mồi M13 R (10pM) 1,0
4) Khuẩn lạc 1,0
5) H2O cho PCR 9,5
Tổng thể tích 25,0
94oC, 2 phút; 35 chu kì [94oC, 30 giây; 55oC, 30 giây; 72oC, 30 giây]; 72oC, 10 phút; giữ nhiệt ở 4oC
Khuẩn lạc nghi ngờ chứa plasmid tái tổ hợp sau đó được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh ampicilin (nồng độ 100g/mL) từ 12 đến 16 tiếng ở 37oC 200 vòng/phút. Sau đó, tiến hành tách plasmid sử dụng bộ sinh phẩm GenJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo) theo quy trình nhà sản xuất cung cấp như sau:
- Ly tâm thu cặn vi khuẩn sau khi nuôi lắc 12 đên 16 tiếng 8000 vòng/phút trong 2 phút. Hút bỏ dịch nổi.
- Bổ sung 250µl Resuspension Solution (đã bổ sung Rnase A) vào trong eppendoff có chứa cặn vi khuẩn. Trộn đều bằng pipet cho đến khi cặn tan hoàn toàn.
- Bổ sung 250µl Lysis Solution, úp ngửa ống eppendoff 4 đến 6 lần hoặc đến khi dung dịch đồng nhất.
- Bổ sung 350µl Neutralization Solution, úp ngửa ống eppendoff 4-6 lần. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút.
- Đặt cột lên trên ống thu. Chuyển toàn bộ dịch trong lên trên cột (tránh hút phải cặn). Ly tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút.
- Đổ bỏ dịch trong ống thu. Bổ sung 500µl Wash Solution vào trong cột, ly tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút. Bước này lặp lại 2 lần.
- Đổ bỏ dịch trong ống thu. Ly tâm khan 12000 vòng/phút trong 2 phút để loại bỏ hoàn toàn Wash Solution.
- Bổ sung 50µl Elution Buffer, để ủ 2 đến 3 phút ở nhiệt độ phòng sau đó ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút.
- Sản phẩm được bảo quản ở -20oC.
Sau đó, plasmid tái tổ hợp được kiểm tra bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu vector M13 (For&/Rev) để kiểm tra chính xác sự có mặt của trình tự gen Microsporidia trong vector tiếp nhận pTZ57R/T. Thành phần và điều kiện của phản ứng PCR đã được trình bày trong Bảng 2.10.
CHƯƠNG III
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU