2. Hóa chất, thiết bị
3.4. Thử nghiệm kỹ thuật PCR và Realtime PCR phát hiện Microsporidia trên các
trên các mẫu bệnh phẩm viêm kết giác mạc mắt
Sau khi đã xây dựng được quy trình chẩn đoán Microsporidia bằng phương pháp PCR và Realtime PCR, chúng tôi tiến hành thu thập các mẫu bệnh phẩm viêm kết giác mạc mắt nghi ngờ nhiễm Microsporidia tại bệnh viện Mắt Trung Ương. Có 30 mẫu bệnh phẩm được thu thập có kết quả nhuộm soi.
Kết quả nhuộm soi:
Các mẫu dương tính từ 1 đến 3 : mẫu số 1,2, 3,4,5,6, 7, 9, 11,12, 13,15, 16, 19, 21, 22, 27,28,29,30.
Các mẫu nghi ngờ: mẫu số 14, 15, 17, 24 và 25.
Chúng tôi tiến hành tách chiết ADN tổng số theo phương pháp đã được mô tả ở chương II, sau đó áp dụng quy trình kỹ thuật PCR và Realtime PCR để tiến hành đánh giá so sánh hiệu quả của hai kỹ thuật trên với kỹ thuật nhuộm soi hiện nay đang được sử dụng tại bệnh viện Mắt Trung Ương.
A
Hình 3.12. A,B. Kết quả điện di PCR 30 mẫu bệnh phẩm thu thập từ bệnh viện Mắt Trung Ương.
Đường chạy từ 1 đến 30: sản phẩm điện di tương ứng lần lượt với 30 mẫu bệnh phẩm thu thập được. Pos: chuẩn dương. Ne: chuẩn âm. M; thang ADN chuẩn.
A
Hình 3.13 A. Kết quả Realtime PCR 30 mẫu bệnh phẩm thu thập từ bệnh viện Mắt Trung Ương.
Các đường tín hiệu: các mẫu bệnh phẩm dương tính có mã số lần lượt 3, 7, 9, 11, 13 và 14.
B
Hình 3.13 B. Kết quả Realtime PCR 30 mẫu bệnh phẩm thu thập từ bệnh viện Mắt Trung Ương. Các đường tín hiệu: các mẫu bệnh phẩm dương tính có mã
Bảng 3.2. Bảng tổng hợp số liệu kết quả phát hiện Microsporidia trên 30 mẫu bệnh phẩm lâm sàng bằng 3 phương pháp nhuộm soi, PCR, realtime
PCR. Mẫu bệnh phẩm
(kí hiệu)
Kết quả vi sinh Kết quả sinh học phân tử
Nhuộm soi PCR Realtime PCR
1 Âm tính Âm tính Âm tính
2 Âm tính Âm tính Âm tính
3 Dương tính Dương tính Dương tính
4 Âm tính Âm tính Âm tính
5 Âm tính Âm tính Âm tính
6 Âm tính Âm tính Âm tính
7 Dương tính Dương tính Dương tính
8 Âm tính Âm tính Âm tính
9 Dương tính Dương tính Dương tính
10 Âm tính Âm tính Âm tính
11 Dương tính Dương tính Dương tính
12 Âm tính Âm tính Âm tính
13 Dương tính Dương tính Dương tính
14 Nghi ngờ Dương tính Dương tính
15 Nghi ngờ Âm tính Âm tính
16 Dương tính Dương tính Dương tính
17 Nghi ngờ Dương tính Dương tính
18 Âm tính Âm tính Âm tính
19 Dương tính Dương tính Dương tính
20 Âm tính Âm tính Âm tính
21 Dương tính Dương tính Dương tính
22 Dương tính Dương tính Dương tính
23 Âm tính Âm tính Âm tính
24 Nghi ngờ Dương tính Dương tính
25 Nghi ngờ Âm tính Âm tính
26 Âm tính Âm tính Âm tính
27 Dương tính Dương tính Dương tính
28 Dương tính Dương tính Dương tính
29 Âm tính Âm tính Âm tính
Bảng 3.3. Kết quả phát hiện Microsporidia trên 30 mẫu bệnh phẩm lâm sàng.
Kết quả chẩn đoán
Microsporidia
Dương tính Âm tính Nghi ngờ Tổng số
PCR 14 16 0 30
Realtime PCR
15 15 0 30
Nhuộm soi 11 14 5 30
Kết quả ở Bảng 3.3 cho thấy
- Kỹ thuật PCR phát hiện được 14/30 mẫu dương tính với Microsporidia so với 11/30 của phương pháp nhuộm soi. 11/11 mẫu dương tính nhuộm soi đều dương tính với PCR. Trong 5 mẫu phương pháp nhuộm soi nghi ngờ thì phương pháp PCR phát hiện được 3 mẫu dương tính và 2 mẫu âm tính.
- Kỹ thuật Realtime PCR phát hiện được 15/30 mẫu dương tính với
Microsporidia so với 11/30 của phương pháp nhuộm soi. 11/11 mẫu dương tính nhuộm soi đều dương tính với Realtime PCR. Trong 5 mẫu phương pháp nhuộm soi nghi ngờ thì phương pháp Realtime PCR phát hiện được 4 mẫu dương tính và 1 mẫu âm tính.
- Kỹ thuật Realtime PCR phát hiện được mẫu số 25 dương tính (Ct 39) so với kỹ thuật PCR trả lời âm tính và nhuộm soi trả lời kết quả nghi ngờ cho thấy độ nhạy của phương pháp realtime PCR là tốt hơn.
Bàn luận
Trong chẩn đoán thường quy, xét nghiệm cần thiết kế tối ưu dễ dàng cho việc thực hiện với mục đích hạn chế lỗi có thể xẩy ra trong quá trình thao tác, điều quan trọng cần có độ nhạy và độ đặc hiệu chẩn đoán cao. Các phương pháp sử dụng để phát hiện Microsporidia như soi trực tiếp bào tử Microsporidia trong mẫu bệnh phẩm chất nạo giác mạc, sử dụng các kỹ thuật nhuộm, nuôi cấy và
PCR. Trong đó kỹ thuật nhuộm soi trực tiếp bào tử Microsporidia cho kết quả với độ nhạy cao. Tuy nhiên, đây cũng là kỹ thuật đòi hỏi tính chuyên nghiệp cao và mẫu bệnh phẩm ngay sau khi thu thập lập tức phải dàn lam, bất kỳ lí do trì hoãn nào trong kỹ thuật nhuộm, đặc biệt nhuộm với postassium hydroxide và trắng calcofluor (là phương pháp nhuộm có độ nhạy cao phát hiện bảo từ
Microsporidia), có thể làm mẫu dàn tiêu bản bị khô ảnh hưởng đến tín hiệu huỳnh quang từ mẫu tiêu bản được nhuộm. Kỹ thuật nuôi cấy Microsporidia đòi hỏi phòng thí nghiệm được trang bị đầy đủ về trang thiết bị nuôi cấy nên chi phí cao, bên cạnh đó kỹ thuật nuôi cấy mất nhiều thời gian là những điểm hạn chế chính của phương pháp này ở các Bệnh viện.
Nghiên cứu mô tả kỹ thuật PCR để phát hiện các vùng trình tự khác nhau của tiểu phần lớn và tiểu phần nhỏ ribosome và vùng nối giữa các gen để chẩn đoán và phân biệt chủng Microsporidia gây bệnh trên người. Trong nghiên cứu này, chúng tôi bước đầu xây dựng quy trình phát hiện Microsporidia bằng kỹ thuật PCR trên mẫu bệnh phẩm viêm giác mạc sử dụng cặp mồi khuếch đại đặc hiệu cho trình tự tiểu phần nhỏ ribosome, small-subunit (SSU) rRNA. Cặp mồi này được thẩm định về phương pháp để phát hiện vùng gen của bốn chủng E. hellem, E. cuniculi, E. intestinalis T. hominis. and V. corneae, được mô tả gây bệnh trên mắt của người. Joseph và cộng sự đánh giá hiệu quả chẩn đoán của kỹ thuật PCR phát hiện trình tự 16S rRNA Microsporidia gây bệnh về mắt với độ nhạy và đặc hiệu tương ứng phát hiện là 83% và 98%. Trong nghiên cứu này, với số lượng mẫu bệnh phẩm còn ít nhưng kỹ thuật PCR cho phép phát hiện 14/30 mẫu dương tính với Microsporidia, 17 mẫu cho kết quả âm tính; kỹ thuật Realtime PCR phát hiện được 15/30 mẫu dương tính. 11/11 mẫu dương tính với PCR và Realtime PCR đều cho kết quả dương tính nhuộm soi. So sánh với kết quả nhuộm soi ở Bảng 3.3 cho thấy, kết qủa PCR và Realtime PCR và kết quả nhuộm soi là có sự khác biệt về giá trị chẩn đoán. Có 04 trường hợp nhuộm soi nghi ngờ được khẳng định dương tính khi sử dụng kỹ thuật PCR và Realtime
PCR, 01 trường hợp nhuộm soi nghi ngờ được khẳng định là âm tính. Tuy nhiên, số liệu này không có ý nghĩa về mặt thống kê do cỡ mẫu nghiên cứu còn ít.
Độ nhạy của kỹ thuật PCR và Realtime PCR trong nghiên cứu này được chúng tôi đánh giá bằng cách pha loãng tới hạn nồng độ ADN tổng số tách chiết từ mẫu bệnh phẩm soi dương tính với Microsporidia. Kết quả cho thấy, kỹ thuật PCR cho phép phát hiện 22,4 fg/L nồng độ ADN của Microsporidia trong mẫu bệnh phẩm, độ nhạy của kỹ thuật Realtime PCR là 2,24 fg/L. Độ đặc hiệu của kỹ thuật PCR và Realtime PCR cũng được chúng tôi đánh giá trên chủng nấm
Aspergillus sp, Fusarium sp, chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, và mẫu bệnh phẩm dương tính với virus HSV và CMV. Kết quả khẳng định cặp mồi sử dụng khuếch đại trình tự gen tiểu phần nhỏ ribosome của Microsporidia không bắt cặp không đặc hiệu với các chủng nấm, vi khuẩn và mẫu bệnh phẩm dương tính với virus kể trên.
Kỹ thuật nhuộm soi không định danh được loài Microsporidia, trong khi kỹ thuật PCR, giải trình tự và định danh loài có thể dễ dàng thực hiện trong thời gian ngắn từ 2-3 ngày. Kỹ thuật phân lập nuôi cấy có thể phát hiện đặc hiệu loài, tuy nhiên giá thành cao và thời gian trả lời kết quả sau 2-3 tuần, trong khi kỹ thuật PCR và Realtime PCR cho kết quả chẩn đoán trong vòng 24 giờ. Các kết quả công bố trên thế giới cho thấy, phần lớn Microsporidia gây bệnh mắt ở người là các loài V. corneae, T. hominis. E. hellem, E. cuniculi và E. intestinalis.
Tuy nhiên đây là kết quả nghiên cứu bước đầu trên số lượng mẫu bệnh phẩm còn giới hạn, cần đánh giá hai kỹ thuật này trên số lượng mẫu bệnh phẩm lâm sàng nhiều hơn có so sánh đánh giá với kết quả nhuộm soi để áp dụng thường quy trong thực hành lâm sàng, nhằm giảm thời gian xét nghiệm, đưa ra được phác đồ điều trị hợp lý cho bệnh nhân, giảm thiểu chi phí điều trị.
KẾT LUẬN
- Kỹ thuật PCR phát hiện Microsporidia trong mẫu bệnh phẩm viêm giác mạc đã được xây dựng thành công:
Độ nhạy là 2.24x10-2pg/µL Độ đặc hiệu là 100%.
Thời gian xét nghiệm trong vòng 6h.
- Kỹ thuật Realtime PCR phát hiện Microsporidia trong mẫu bệnh phẩm viêm giác mạc đã xây dựng thành công:
Độ nhạy là 0.224x10-2pg/µL Độ đặc hiệu là 100%.
Thời gian xét nghiệm trong vòng 3h.
Tuy nhiên đây là kết quả nghiên cứu bước đầu trên số lượng mẫu bệnh phẩm còn giới hạn, cần đánh giá kỹ thuật này trên số lượng mẫu bệnh phẩm lâm sàng nhiều hơn có so sánh độc lập với kỹ thuật nhuộm soi để có thể áp dụng trong chẩn đoán thường quy.
KIẾN NGHỊ
Hướng nghiên cứu tiếp theo của chúng tôi:
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt
1. Phan Dẫn, Phạm Trọng Văn, Vũ Quốc Lương (2001), Giác mạc, giải phẫu-sinh lý- miễn dịch- phẫu thuật, Nhà xuất bản Y học, tr.3-48.
2. Phạm Ngọc Đông (2015), “MICROSPORIDIA: TÁC NHÂN VIÊM GIÁC MẠC NHU MÔ LẦN ĐẦU TIÊN ĐƯỢC PHÁT HIỆN Ở VIỆT NAM”, Bệnh viện Mắt TW.
3. Hoàng Thị Minh Châu (2007), “Giác mạc”, Nhãn khoa giản yếu, tập 1, Nhà xuất bản Y học, tr.146-203.
4. Lê Anh Tâm (2008), Nghiên cứu tình hình viêm loét giác mạc tại bệnh viện Mắt trung ương trong 10 năm (1998 - 2007), Luận văn Thạc sĩ y học, Trường Đại học Y Hà Nội.
5.Nguyễn Xuân Trường (2005), “Viêm loét giác mạc”, Giáo trình nhãn khoa, Nhà xuất bản Giáo dục, tr.143-179.
6. Lê Minh Thông (2005), “Giải phẫu và sinh lý mắt”, Giáo trình nhãn khoa, Nhà xuất bản giáo dục, tr.9-92.
7. Hội nhãn khoa Mỹ (1997), “Giác mạc”, Bệnh học của mi mắt, kết mạc và giác mạc, Nhà xuất bản Y học, tr.74-91.
Tài liệu tiếng anh
8. Baum,J., and M.Barza., 1998. Infections of the eye , Infectious diseases.p .1355–1373.
9. Butrus, S.I., and S.A.Klotz. 1986. Blocking Candida adherence to contact lenses.Curr.EyeRes. 5:745–750.
10. Chamberlain, J. S., R. A. Gibbs, et al. (1988). "Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification." Nucleic Acids Res 16(23): 11141-56.
11. Garg P. (2013), "Microsporidia infection of the cornea--a unique and challenging disease". Cornea. 32 Suppl 1: p. S33-8.
12. Joveeta Joseph, Somasheila Murthy, Prashant Garg and Savitri Sharma1 (2006), Use of Different Stains for Microscopic Evaluation of Corneal Scrapings for Diagnosis of Microsporidial Keratitis.
13. Keratoconjunctivitis in immunocompetent patient in Southern India 14. Liesegang TJ, Foster RF (1980), “Spetrum of microbial keratitis in South Florida”, Am J Ophthalmol, 90, pp.38-47.
15. Loffler, J., H. Hebart, et al. (1997). "Comparison of different methods for extraction of DNA of fungal pathogens from cultures and blood." J Clin Microbiol 35(12): 3311-2.
16. Lee et al. Microsporidia Evolved from Ancestral Sexual Fungi. Current Biology, 2008.
17. Maurice và Giardini (1961), Vegetative Physiology and Biochemistry: The Eye
18. Sharma S, Srinivasan M, George C (1993), “Current status of Fusarium species in mycotic keratitis in South India”, J Med Microbiol, 11, pp.140 – 147.
19. Schell WA, Foulk GN, Perfect JR (2008), “Chapter 15: Fungal infection of the eye”, Principles and practice of ophthalmology, vol 1, W.B Saunder company, pp.159-168.
20. Sanjay Kai, M Vanathi, Anita Panda (2009), Corneal Microsporidiosis 21. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. (1989). Molecular cloning I-III. A Laboratory Mannual Cold Spring Harbor Laboratory Press, London, UK.
22. Upadhyay MP, Karmacharya PC, Koirala S, Smolin G, et al (1991), “Epidemiologic Character istics, predisposing factors, and etiologic diagnosis of corneal ulceration in Nepal”, Am J Opthalmol, 111, pp.92-99.