Hóa chất
• GAGA (Sigma)
• Ethanol (Merck)
• Acid boric (Merk)
• Muối natri borat
• Acetone (Merck)
Pha đệm borat
Dung dịch acid boric 0,2M: cân 12,404g H3BO3 hòa tan và định mức đến 1000ml
• Dung dịch B
Dung dịch muối natri borat 0,05M: cân 19,018g Na2B4O7.10H2O hòa tan và định mức đến 1000ml
Trộn 9,4ml dung dịch A và 0.6 ml dung dịch B thì thu được đệm borat pH=7,09
Dựng đường chuẩn GABA
GABA được sấy khô ở 105oC trong 2 giờ, cân 0,2g GABA trong 10ml nước cất- được stock solution 20mg/ml, hút 1ml stock solution vào 9ml nước cất được stock solution 1 có nồng độ 1 có nồng độ 2mg/ml. Sau đó dùng stock solution 1 để pha loãng thành các dãy nồng độ sau từ 0; 0,2; 0,4;…; 2.
Cách dựng đường chuẩn
• Hút 0,5 ml dung dịch GABA ở các nồng độ khác nhau cho vào các ống nghiệm định lượng
• Bổ sung 3ml dung dịch đệm borat và 0,5ml dung dịch nihydrin (2% w/v nihydrin trong acetone)
• Đun sôi hỗn hợp trong vòng 20 phút tại 85±5oC
• Làm lạnh nhanh trong nước đá 5 phút
• Để hỗn hợp có nhiệt độ bằng nhiệt độ phòng, bổ sung 2ml ethanol 50%
• Đo hỗn hợp OD 570 nm, dùng Blank là mẫu có nồng độ 0mg/ml.
• Lặp lại thí nghiệm 2 lần để thu được gía trị OD1 và OD2.
Từ bảng dưới đây, ta thu được phương trình tuyến tính là Y=1.1817*X- 0.0448 với R=0.9925 ( R là độ tin cậy), Y là nồng độ GABA (mg/ml), X là giá trị OD 570 nm.
Mẫu thí nghiệm: Chấm 500μl các mẫu thí nghiệm lên bản TLC và chạy trong dung môi như định tính. Sau đó cạo lớp bột trên bản TLC cho vào các ống
định lượng chứa 500μl nước cất, ly tâm thu dịch trong và làm tương tự các bước tiếp theo như mẫu đối chứng. Từ đó, dựa vào phương trình tuyến tính ta tính được lượng GABA có trong các mẫu thí nghiệm.
Bảng 2: Mật độ quang phổ (OD 570nm) ở các nồng độ GABA khác nhau
2.4.3. Phương pháp phân loại
2.4.3.1. Phân loại dựa trên phân tích trình tự rDNA
Tách DNA vi khuẩn Nồng độ (mg/ml) Stock solution 1(µl) Nước cất (µl) OD1 (570nm) OD2 (570nm) 0 0 1000 Blank Blank 0,2 100 900 0,168 0,135 0,4 200 800 0,345 0,365 0,6 300 700 0,652 0,653 0,8 400 600 1,045 0,992 1,0 500 500 1,175 1,1715 1,2 600 400 1,464 1,4525 1,4 700 300 1,521 1,525 1,6 800 200 1,874 1,8365 1,8 900 100 2,053 1,989 2 1000 0 2,405 2,39
DNA của các chủng vi khuẩn được tách chiết theo phương pháp của Gabor và cộng sự (2003) [22] với một số bước cải tiến để phù hợp với phòng thí nghiệm. Đầu tiên, các chủng vi khuẩn giữ trong ống lạnh sâu được cấy ria trên môi trường MRS. Sau 24 giờ nuôi ở 37oC, lấy các khuẩn lạc thuần khiết mọc trên thạch đưa vào các ống 1,5ml chứa 200 µl đệm phá tế bào (100 mM Tris HCl, 100 mM Na2EDTA, 1,5 mM NaCl, pH 8,0), 10 µl lysozyme (50mg/ml) và 10 µl proteinase K (10mg/ml). Hỗn hợp đệm này được ủ ở 37oC trong 30 phút. Sau khi bổ sung thêm 50 µl SDS 10%, hỗn hợp này được ủ thêm 56 oC trong 2 giờ nhằm phá vỡ hoàn toàn tế bào và giải phóng DNA vào đệm chiết. Bổ sung một lượng tương đương (~250 µl) hỗn hợp chloroform: isoamyl alcohol (49:1) và hỗn hợp chứa các tế bào đã bị phá vỡ, mix trong một phút sau đó ly tâm 15000 vòng/phút trong 7 phút. Hút150 µl phần dịch trong phía trên có chứa DNA sang ống Eppendoft mới. Thêm 120 µl isopropanol lạnh vào và ủ ở -20 oC trong 1 giờ để DNA dễ dàng kết tủa. Tiến hành ly tâm 15000 vòng/phút để thu hồi DNA kết tủa. Rửa tủa bằng cồn lạnh 70 oC và hòa tan vào 50-100 µl đệm TE (10 mM Tris HCl, 0,1 mM Na2EDTA). Cất giữ DNA ở -20 oC cho đến khi sử dụng.
Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen 16s rRNA
Phản ứng PCR được sử dụng để khuếch đại đoạn rRNA16S với cặp mồi (27F: (5'- AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG -3') và 1525R (5'- AAAGGAGGTGATCCA GCC-3'). Chu trình nhiệt: 950C - 3 phút 950C - 30giây 560C - 15 giây 30 chu kỳ 720C - 1 phút
720C - 5 phút
40C -
Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di trên gel agarose 1% (dung dịch 50X TAE: 2ml, nước cất: 98 ml, agarose: 1g) để ấm, bổ sung Redsafe theo tỷ lệ 1µl/15 ml gel, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong 300ml dung dịch 1 X TAE. Trộn 1 l dung dịch 6X loading buffer với 5 l mẫu trộn đều, nhỏ vào giếng. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100V, cường độ dòng điện 80 mA trong 30 phút, quan sát trên máy soi gel.
Giải trình tự gen 16S rRNA
Sản phẩm PCR được tinh sạch sử dụng kit Qiaquick của hãng Qiagen. Nồng độ DNA tinh sạch được đo trên máy quang phổ tại bước sóng 260 nm. Với mỗi phản ứng giải trình tự, 20 g sản phẩm PCR tinh sạch được đưa vào các phản ứng khuếch đại sử dụng kit Bigdye terminator v3.1 theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Applied Biosystem). Với mỗi sản phẩm PCR, trình tự đoạn DNA 16S được phân tích với 4 mồi riêng biệt:
27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'.
1525R: 5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3'.
780F: 5'-GAATTGATACCCTGGTAG-3.'
920R: 5'-GTCAATTCCTTTGAGTTT-3'.
Tình tự DNA được đọc trên máy giải trình tự 3100 Avant Genetic Analyzer sử dụng POP-6 polymer. Sắc đồ trình tự được kiểm tra và chỉnh sửa trên phần mềm Chrome lite 2.1. Trình tự của 4 mồi 27F, 1525R, 780F, 920R được kết nối với phần mềm Clone Manager. Mức độ tương đồng về trình tự gen mã hóa riboxom 16S của các chủng nghiên cứu so với các chủng đã công bố trên ngân hàng gen được so sánh sử dụng công cụ tra cứu BLAST
(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Mức độ tương đồng cao nhất về trình tự đoạn 16S rDNA của các chủng nghiên cứu so với các chủng chuẩn đã được tra cứu sử dụng cơ sở dữ liệu Eztaxon-e (https://www.ezbiocloud.net/).
Xây dựng cây phát sinh chủng loại
Cây phát sinh được xây dựng theo Kimura (1980)[34], sử dụng phương pháp của Saitou và Nei (1987)[53]. Phân tích bootstrap được thực hiện từ 1000 lần lặp lại ngẫu nhiên, chỉ có những giá trị trên 50% được thể hiện. Mã số của ngân hàng gen được ghi sau tên loài.