Các chủ ng vi khuẩn nghiên cứu đươ ̣c nuôi trong môi trường và nhiê ̣t đô ̣ thích hơ ̣p, pH ban đầu của môi trường đươ ̣c chỉnh ở các giá tri ̣: 4; 5; 6; 7; 8. Sau 48 giờ nuôi, mâ ̣t đô ̣ tế bào được xác đi ̣nh. Kết quả được thể hiện trong Bảng 3.9:
Bảng 3.9: Khả năng sinh GABA và sinh trưởng của 4 chủng vi khuẩn lactic khi nuôi cấy ở các pH khác nhau
STT Kí hiệu chủng Chỉ tiêu phân tích pH=4 pH=5 pH=6 pH=7 pH=8 1 VTCC- B-421 Hàm lượng GABA(mg/ml) 0,432 0,602 0,618 0,512 0,230 OD (λ=600nm) 1,08 1,82 2,02 1,70 0,71 2 VTCC- B-431 Hàm lượng GABA(mg/ml) 0,412 0,615 0,662 0,532 0,245 OD (λ=600nm) 1,13 1,98 2,12 1,82 0,82 3 VTCC- B-426 Hàm lượng GABA(mg/ml) 0,304 0,604 0,632 0,566 0,169 OD (λ=600nm) 0,89 1,75 2,08 1,45 1,07 4 VTCC- B-1450 Hàm lượng GABA(mg/ml) 0,307 0,542 0,532 0,476 0,128 OD (λ=600nm) 0,76 1.85 1,98 1,40 0,89
Dựa vào bảng trên ta thấy, các chủng nghiên cứu có khả năng sinh trưởng và sinh GABA tốt nhất ở pH=5-6, giảm mạnh ở pH =4 và 8. Kết quả này khá trùng với nghiên cứu của tác giả Y.R.Cho và cộng sự (2007). Y.R.Cho và cộng sự đã chỉ ra rằng pH môi trường nuôi cấy tối ưu cho
Lactobacillus buchneri được phân lập từ kim chi là pH=5 [11]. Chủng có hoạt tính GABA mạnh nhất trong 4 chủng nghiên cứu là chủng VTCC-B-431, hàm lượng GABA đạt tới 6,62(mg/ml) khi nuôi cấy trên môi trường cám gạo, nhiệt độ 37oC ở pH ban đầu= 6.
Để sàng lọc các chủng Lactobacillus sinh GABA chúng tôi sử dụng kỹ thuật sắc kí bản mỏng (TLC). Kỹ thuật phân tích này nhanh và tiện ích cho việc sang lọc ban đầu với số mẫu lớn trong nghiên cứu này (100 chủng). Kỹ thuật này cũng được sử dụng trong nhiều nghiên cứu trước đây ở bước phân tích ban đầu khả năng sinh GABA của vi sinh vật [4],[47]. Với 4 chủng đã được tuyển chọn qua bước sang lọc ban đầu (VTCC-B-421, VTCC-B-431, VTCC-B-426 và VTCC-B-1450), chúng tôi tiếp tục sử dụng phương pháp phân tích định lượng so màu theo các nghiên cứu trước đây [26],[59]. Các nghiên cứu xác định lượng GABA được tổng hợp từ môi trường thông thường sử dụng cả 3 kỹ thuật: TLC, so màu và phân tích trên thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)[11]. Các kết quả phân tích định lượng GABA theo phương pháp so màu và sử dụng HPLC là các phương pháp phân tích định lượng chính xác nên chúng tôi sử dụng phương pháp phân tích so màu cho các nghiên cứu của mình. Kết quả định lượng GABA với các chủng lựa chọn trong điều kiện nghiên cứu dao động từ 0,542-0,662 (mg/ml) (Bảng 3.8). Kết quả này cũng phù hợp với một số nghiên cứu trước đây: S.Y.Park khi nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic sinh GABA từ kim chi đã phân lập được 273 chủng vi khuẩn lactic từ 48 mẫu kim chi khác nhau và chọn được chủng K255 sinh GABA cao nhất. Chủng này được định danh là
Lactobacillus platarum K255 và tích lũy được 821,24µg /ml GABA trên môi trương MRS có 3% glutamate natri (SMG) [47]. Một nghiên cứu khác của Lý Quốc Đạt và cộng sự [16] cho thấy khi nuôi cấy các chủng Lactobacillus brevis VTCC-B-454 trên môi trường cám gạo tách dầu, lượng GABA sau 24 giờ lên men đạt 2,952ppm. Một nghiên cứu khác: H. Li đã tiến hành lên men
bán liên tục (fed-batch cultrure) với chủng Lactobacillus brevis NCL912 và nhận thấy lượng GABA được tích lũy lượng lớn tới 1000 mM trên môi trường tại thời điểm 36h và không phát hiện thấy lượng GABA được hình thành thêm sau đó [41].
Với mục tiêu sản xuất GABA từ vi khuẩn lactic, các nghiên cứu hiện nay đã thu được nhiều kết quả khích lệ. Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào con đường chuyển hóa từ glutamat thành GABA với xúc tác của enzyme glutamate decacboxylase:
Hình 3.11: Con đường chuyển hóa glutamate thành GABA.
Với cách tiếp cận này, việc bổ sung glutamate như là tiền chất thực tế đã làm tăng lượng GABA trong dịch lên men. Trên môi trường MRS, việc bổ sung glutamate ở các mức độ 1%, 2%, 3% đã nhận thấy lượng GABA trong môi trường tương ứng là 387 µg/ml;600 µg/ml và 821 µg/ml [47]. Một số nghiên cứu còn ứng dụng kỹ thuật di truyền trong việc biểu hiện gen mã hóa cho enzyme glutamate decacboxylase làm tăng hiệu quả chuyến hóa [37] nhưng việc chuyển hóa sinh học từ glutamate thành GABA áp dụng cho sản xuất quy mô công nghiệp cần được xem xét hiệu quả kinh tế so với các điều kiện môi trường không bổ sung glutamate.
CHƯƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
1.Từ 100 chủng vi khuẩn Lactobacillus đã lựa chọn được 4 chủng:
VTCC-B-1450, VTCC-B-421, VTCC-B-431, VTCC-B-426 có khả năng sinh GABA cao.
2. Đã lựa chọn được môi trường cám gạo, nhiệt độ 37oC và pH=5-6 là thích hợp cho khả năng sinh GABA và sinh trưởng của 4 chủng vi khuẩn lựa chọn. 3. Kết quả kết hợp giữa nghiên cứu hình thái và phân tích tương đồng trình tự rDNA 16S cho thấy các chủng này được định danh như sau: chủng VTCC-B- 431 và VTCC-B-426 giống với loài Lactobacillus paracasei, chủng VTCC-B- 421 giống với loài Lactobacillus brevis và chủng VTCC-B-1450 giống với loài Lactobacillus buchneri.
4. Cả 4 chủng sinh GABA đều có tiềm năng cho nghiên cứu phát triển probiotic, có khả năng tồn tại trong đường tiêu hóa như: chịu axit, chịu muối mật, có khả năng sống sót trong dịch dạ dày và dịch ruột, sự có mặt các chất kháng sinh, khả năng bám dính ruột, sinh bacteriocin, sinh axit lactic, tuy nhiên chủng VTCC-B-431 là chủng có tiềm năng nhất về khả năng sinh GABA cao (0,662mg/ml).
KIẾN NGHỊ VÀ ĐỀ XUẤT
Sau khi thực hiện đề tài chúng tôi đưa ra một số đề xuất như sau:
GABA là một chất có ứng dụng quan trọng đối với con người, đặc biệt là trong lĩnh vực y học. Trong luận văn này, những nghiên cứu của chúng tôi chỉ là những nghiên cứu sơ bộ ban đầu, chưa để đi vào thực tế. Vậy nên chúng tôi xin kiến nghị một số vấn đề cần nghiên cứu sâu hơn để có thể đưa GABA vào trong quá trình sản xuất và ứng dụng thực tế.
-Cần chạy HPLC – sắc kí lỏng hiệu năng cao để xác định chắc chắn về khả năng sinh GABA của các chủng vi khuẩn lactic.
-Tối ưu các điều kiện nuôi cấy, khảo sát thêm sự sinh trưởng, phát triển và khả năng sinh GABA của các chủng vi khuẩn lactic khác nhau khi thay đổi các điều kiện môi trường (thời gian nuôi cấy, tỷ lệ giống cấy, thành phần môi trường, lượng Sodium glutamate bổ sung thích hợp…).
-Xây dựng quy trình lên men để đưa các chủng nghiên cứu vào sản xuất thực phẩm chức năng giàu GABA.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TiếngViệt
1. Nguyễn La Anh, Quách Thị Việt, Đặng Thu Hương, Trần Thị Ngoan (2013),
Nghiên cứu khả năng bám dính của một số chủng vi khuẩn probiotic trên màng nhầy ruột in vitro, Hội nghị khoa học công nghệ sinh học toàn quốc 2013, tr. 40-44.
2. Trịnh Tất Cường (2012), Nghiên cứu qui trình sản xuất acid Gamma- aminobutyric từ lên men dịch cám gạo bằng Lactobacillus để ứng dụng làm thực phẩm chức năng, Báo cáo tổng hợp kết quả đề tài cấp nhà nước KC10.TN/11-15.
3. Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972). Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học. NXB Khoa học và Kỹ thuật.
4. Dương Minh Khải (2013). Nghiên cứu vi khuẩn lactic có khả năng probiotic, sinh tổng hợp Gamma-aminobutiric acid và ứng dụng. Luận văn thạc sĩ, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội.
5. Đào Thị Lương, Nguyễn Thị Anh Đào, Nguyễn Thị Kim Quy, Trần Thị Lệ Quyên, Dương Văn Hợp (2010), “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic dùng trong chế biến và bảo quản thức ăn thô xanh và phụ phẩm nông nghiệp cho gia súc nhai lại”, Tạp chí Di truyền học và ứng dụng, Chuyên san Công nghệ Sinh học, 6, tr.1- 4.
6. Nguyễn Văn Mùi (2001), Thực hành hóa sinh học, Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Hà Nội.
7. Quách Thị Việt, Dương Minh Khải, Đặng Thu Hương, Trần Thị Ngoan, Nguyễn La Anh (2013), Nghiên cứu đặc điểm chủng vi khuẩn probiotic Lactobacillus brevis NCTH24 có khả năng sinh tổng hợp Gama - aminobutyric acid và ứng dụng trong sản xuất Bio – yogurt, Hội nghị Khoa học Công nghệ Sinh học toàn quốc 2013, tr. 649-653.
Tiếng Anh
8. Balasingham K., Valli C., Radhakrishnan L., Balasuramanyam D.(2017), “Probiotic characterization of lactic acid bacteria isolated from swine intestine”, Veterinary World, 10(7), pp.825-829.
9. Bauer A.W., Kirby W.M., Sherris J.C., Turck M.(1966), Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method, American journal of clinical pathology, 45(4).
10. Castor J.G.B.(1953), The B-complex vitamins of musts and wines as microbial growth factors, Applied Microbiology, (1), pp.97-102.
11. Cho Y.R., Chang J.Y., Chang H.C.(2007), Production of γ-aminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus buchneri isolated from Kimchi and its Neuroprotective Effect on Neuronal Cells. Journal of Microbiology and Biotechnology, 17(1), pp.104-109.
12. Chauhan P.B., Daru D.(2016), “ Isolation and characterization of Lactobacillus
isolated from milk, curd and fecal sample and asigning their probiotic”, International Journal of Pharma and Bio Sciences, 7(3), pp.1070-1075.
13. Collins M.D., Gibson G.R.(1999), Probiotics, prebiotics, and synbiotics: approaches for modulating the microbial ecology of the gut, American Society for Clinical Nutrition, 69(5), pp.1052-1057.
14.Cossart R., Bernard C., Ben-Ari Y. (2005), "Multiple facets of GABAergic neurons and synapses: multiple fates of GABA signalling in epilepsies", Trends Neurosci, 28(2), pp.108-115.
15. Curtis D.R., Johnston G.A.(1974). Amino acid transmitters in the mammalian central nervous system. Ergebnisse der Physiologie, biologischen Chemie und experimentellen Pharmakologie, 69, pp.97-188. 16. Dat L.Q., Ngan T.T.K., Nu N.T.X.(2017), “Gamma-amino butyric acid
(GABA) synthesis of Lactobacillus in fermentation of defatted rice bran extract”, International Conference on Chemical Engineering Food and Biotechnology, pp.1-7.
17.Del Giudice M., De Luca M.G.(2004), The role of probiotics in the clinical management of food allergy and atopic dermatitis, Journal of Clinical Gastroenterology, 38 (6), pp.84-85.
18.Dhakal R., Bajpai V.K., Baek K.H.(2012), Production of GABA (γ- aminobutyric acid) by Microorganisms, Brazilian Journal of Microbiology, 43(4), pp.1230-1241.
19. Di Cagno R., Mazzacane F., Rizzello C.G., Angelis M.D.E., Giuliani G., Meloni M., Servi B.D.E., Marco G.(2010), Synthesis of γ-aminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus plantarum DSM19463: functional grape must beverage and dermatological applications, Applied Microbiology and Biotechnology, 86, pp.731-741.
20. FAO/WHO (2001), “Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria”, Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria.
21.Fuller R. (1989), Probiotics in man and animals, Journal of Applied Bacteriology, 66, pp.65-78.
22.Gabor E.M., Vries E.J.D., Jansen D.B.(2003), " Efficien recovery of enviromental DNA for expression cloning by indirect extraction method", FEMS Microbiology Ecology, 44(2), pp.153-163.
23.Hayakawa K., Kimura M., Kasaha K., Matsumoto K., Sansawa H., Yamori Y. (2004), Effect of a γ-aminobutyric acid-enriched dairy product on the blood pressure of spontaneously hypertensive and normotensive Wistar–Kyoto rats, British Journal of Nutrition, 92, pp. 411-417.
24. Higuchi T., Hayashi H., Abe K. (1997), Exchange of glutamate and g- aminobutyrate in a Lactobacillus strain, Journal ofBacteriology , 179, pp. 3362–3364.
25. Holzapfel W.H., Haberer P., Snel J., Schillinger U., Huis In’t Veld J.H. (1998), Overview of gut flora and probiotic. International Journal of Food Microbiology, 41(2), pp. 85-101.
26. Hosseinimehr J.S., Fereshteh P., Moshtaghi E., Amini M. (2010), “Colorimetric Determination of Baclofen with Ninhydrin Reagent and Compare with HPLC Method in Tablet”, A.J.Chemistry, 22(1), pp. 522-526.
27.Jena P.K., Trivedi D., Thakore K., Chaudhary H., Giri S.S., Seshadri S. (2013), “Isolation and characterization of probiotic properties of Lactobacilli isolated from rat fecal microbiota”, Microbiol Immunol, 57, pp. 407-416.
28.Jeng K.C., Chen C.S., Fang Y.P., Hou R.C.W., Chen Y.S. (2007), Effect of microbial fermentation on content of statin, GABA, and polyphenols in Pu- Erh tea, Journal Of Agricultural And Food Chemistry, 55, pp. 8787–8792. 29.Jin Z., Mendu S.K., Birnir B. (2011), “GABA is an effective
immunomodulatory molecule”, Amino Acids, 45, pp. 87-94.
30. Juliano R.O. (1985), Rice: Chemistry and Technology. 2nd ed. American Association of Cereal Chemists. St. Paul, Minnesota.
31. Kastner S., Perreten V., Bleuler H., Hugenschmidt G., Lacroix C., Meile L.(2006), Antibiotic susceptibility patterns and resistance genes of starter cultures and probiotic bacteria used in food, Systematic and Applied Microbiology, 29(2), pp.145–155.
32.Kim J. Y., Lee M. Y., Ji G. E., Lee Y. S., Hwang K. T. (2009), Production of γ-aminobutyric acid in black raspberry juice during fermentation by Lactobacillusbrevis GABA100, InternationalJournalof Food
Microbiology, 130, pp. 12–16.
33.Kim S. H., Shin B.H., Kim Y.H., Nam S.W., Jeon S.J. (2007), Cloning and expression of a full-length glutamate decarboxylase gene from Lactobacillus brevis
BH2, Biotechnology and Bioprocess Engineering, 12, pp.707-712.
34.Kimura M.(1980), A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequence, Journal of Molecular Evolution, 16, pp.111-120.
35.Komatsuzaki N., Shima J., Kawamotoa S., Momosed H., Kimurab T. (2005), Production of g-aminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus paracasei isolated from traditional fermented foods, Food Microbiol, 22, pp. 497–504.
36.Kook M.C.,Seo M.J.,Cheigh C.I.,Pyun Y.R.,Cho S.C.,Park H. (2010), Enhanced production of gamma-aminobutyric acid using rice bran extracts by
Lactobacillus sakei B2-16, Journal of Microbiology, 20(4), pp.763-766. 37.Kook M.C., Seo M.J., Cheigh C.I., Lee S.J., Pyun Y.R., Park H.(2010),
“Enhancement of γ-Amminobutyric acid production by Lactobacillus sakei
B2-16 Expressing Glutamate decarboxylase from Lactobacillus plantarum
ATCC 14917”, Journai of the Koorean Society for Applied Biological Chemistry, 53(6), pp.816-820.
38. Kos B., Suskovic J., Goreta J.,and Matosic S. (2000),Effect of protectors on the viability ofLactobacillus acidophilusM92 in simulated gastrointestinal conditions, Food Technology andBiotechnology, 38, pp.121-127.
39. Li H., Cao Y. (2010), Lactic acid bacterial cell factories for gamma - aminobutyric acid, Amino Acids, 39, pp.1107–1116.
40.Li H., Gao D., Cao Y., Xu H. (2008), A high γ-aminobutyric acid- producing Lactobacillus brevis isolated from Chinese traditional paocai, Annals of Microbiology, 58(4), pp.649–653.
41.Li H., Qiu T., Huang G., Cao Y. (2010), “Production of gamma-aminobutyric acid by Lactobacillus brevis NCL912 using fed-batch fermentation”, Microbial Cell Factories, 9(1): 85 .http://www.microbialcellfactories.com/content/9/1/85 42. Lim S., Seo M., Lee J., Nam Y., Lee S., Park S., Yi S., Lee M., Roh S.W,
Cho H. (2013), Production of γ- Aminobutyric Acid by Lactobacillus brevis 340G Isolated from Kimchi and Its Application to Skim Milk. Food Engineering Progress, 17(4), pp. 418–423.
43. Lu X., Xie C., Gu Z. (2008), Isolation of γ-aminobutyric acid-producing bacteria and optimization of fermentative medium, Biochemical Engineering Journal, 41, pp. 48-52.
44. Maras B., Sweene G., Barra D., Bossa F., John R.A. (1992), The amino acid sequence of glutamate decarboxylase from Escherichia coli, European Journal of Biochemistry, 204, pp. 93-98.
45. Miller G.L.(1959): Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry, 31, pp. 426-428.
46. Ouwehand A. C., Salminen S. , Isolauri E. (2002), Probiotic: an overview of beneficial effects, Antonie Van Leeuwenhoek, 82, pp. 279- 289.
47. Park S.Y., Kim K.S., Lee M.K., Lim S.D. (2013), “Physiological Characteristics and GABA Production of Lactobacillus plantarum K255 Isolated from Kimchi”, Korea Food Research Institute, 33(5), pp. 595-602. 48. Patterson J.A., Burkholder K.M.(2003), Application of prebiotics and probiotics in
poultry production, Journal of Animal Science, 82, pp.627-631.
49.Qiu T., Li H., Cao Y. (2010), Pre-staining thin layer chromatography method for amino acid detection, African Journal of Biotechnology, 9(50), pp. 8679-8681.
50.Roberts K.A., Wright J.W., Harding J.W. (1993), GABA and bicuculline- induced blood pressure changes in spontaneously hypertensive rats, Journal of Cardiovascular Pharmacology, 21, pp.156-162.
51. Robert M., Kliegman M.D., Rodney E., Willoughby M.D. (2005), Prevention of Necrotizing Enterocolitis With Probiotics., Pediatrics,115(1), pp.171-172. 52.Saikusa T., Horino T., Mori Y. (1994), Distribution of Free Amino Acids in the
Rice Kernel and Kernel Fractions and the Effect of Water Soaking on the Distribution. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 42(5), pp.1122–1125.
53. Saitou N., Nei M.(1987), “The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees”, Molecular Biology and Evolution, 4, pp.406- 425.
54.Servili M., Rizzello C.G., Taticchi A., Esposto S., Urbani S., Mazzacane F., Di Maio I., Selvaggini R., Gobbetti M., Di Cagno R. (2011), Functional milk beverage fortified with phenolic compounds extracted from olive vegetation
water, and fermented with functional lactic acid bacteria, International Journal of Food Microbiology, 147(1), pp. 45–52.
55.Shelp B.J., Bown A.W. (1997), The Metabolism and functions of γ- Aminobutyric Acid, Plant Physiol, pp.1-5.
56.Shelp B.J., Bown A.W., McLean M.D. (1999). “Metabolism and functions of