2.4.4.1. Phương pháp xác định khả năng sinh trưởng trong môi trường có pH thấp
Nuôi cấy các chủng vi khuẩn lactic trong môi trường MRS dịch thể được điểu chỉnh pH ban đầu ở các giá tri ̣ 2, 3, 4, 5, 6. Sau 24 giờ nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ 37 , tiến hành đo OD ở bước sóng 600nm.
2.4.4.2. Phương pháp xác định khả năng sinh trưởng trong môi trường có bổ sung muối mật
Phương pháp này được áp dụng theo Ouwehand và cộng sự (2002) [46]:
Nuôi cấy các chủng vi khuẩn lactic trong môi trường MRS dịch thể đã được bổ sung muối mật với các nồng độ khác nhau: 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%. Nuôi tĩnh ở 37 trong vòng 24h. Kết thúc thời gian nuôi cấy tiến hành
đo OD ở bước sóng 600nm.
2.4.4.3. Phương pháp xác định khả năng sống trong môi trường dịch dạ dày và dịch ruột giả lập
Phương pháp này được áp dụng theo Kos và cs (2000) [38] có cải tiến. Môi trường dịch dạ dày được chuẩn bị 3g Pepsine trong 1 lít dung dịch đệm glycine-HCl 0,2M; pH 2.
Môi trường dịch ruột giả lập sử dụng 1g pancreatin (Sigma) trong dung dịch 0,5% NaCl chứa 0,3% Ox bile dried pure (Merk).
Chủng vi sinh vật được lên men 24h tại 370C trên môi trường MRS đạt mật độ tế bào khoảng 108-109 (CFU/ml). Sinh khối sau lên men ly tâm tại 10.000 vòng/phút trong 5 phút để thu sinh khối tế bào. Sinh khối tế bào được rửa 2 lần với đệm PBS (0,02% KCl; 0,144% Na2HPO4; 0,8% NaCl; 0,024% KH2PO4; pH 7). Sau đó, thực hiện kiểm tra khả năng sống sót của chủng vi sinh vật trong môi trường dịch dạ dày giả lập ở 120 phút và dịch ruột giả lập ở
240 phút tại nhiệt độ 370C. Kết thúc thời gian ủ, tiến hành trang cấy trên môi trường MRS agar để kiểm tra mật độ tế bào. Mật độ tế bào (CFU/ml) được tính tại thời điểm kết thúc thời gian ủ và thời điểm 0 phút. Tỷ lệ tế bào sống
sót được tính theo phần trăm (%) tại thời điểm sau khi ủ so với thời điểm ban đầu.
2.4.4.4. Phương pháp xác định khả năng bám dínhtrên màng nhầy ruột
Phương pháp được áp dụng theo Ouwehand và cộng sự [46] có cải tiến.
-Phủ màng nhầy ruột lên đĩa vi chuẩn polystyrene 24 giếng:
Chuẩn bị dung dịch chất nhầy (được lấy từ ruột non của lợn) có nồng độ 1,5 mg/ml trong dung dịch HEPES 10mM, pH 7,4. Ly tâm ở chế độ 4000 vòng/phút trong 5 phút tại 40C. Sau đó lọc vô khuẩn bởi màng lọc 0,2µm, bổ sung 0,6ml vào các giếng trên đĩa vi chuẩn polystyrene 24 giếng và ủ qua đêm tại 40C.
-Chuẩn bị sinh khối vi sinh vật:
Dịch lên men vi sinh vật đạt mật độ tế bào khoảng 108-109 (CFU/ml).
Lấy 20ml dịch ly tâm 8000 vòng/phút trong 10 phút tại 40C, rửa 2 lần trong dung dịch HEPES 10mM, pH 7,4 và hòa lại sinh khối trong 4ml dung dịch
này. Lấy mẫu, pha loãng mẫu trong dung dịch NaCl 0,85% pH 6,5; kiểm tra
mật độ tế bào bằng phương pháp trang cấy trên MRS agar, thời gian 48-72h tại 370C.
-Đánh giá khả năng bám dính của tế bào vi khuẩn trên màng nhầy ruột:
Đĩa vi chuẩn sau khi ủ qua đêm được rửa 2 lần bằng dung dịch HEPES, tiếp đó bổ sung 0,4ml dịch sinh khối vi sinh vật, ủ tại 370C trong 1h. Kết thúc
thời gian ủ, thực hiện rửa 2 lần nhằm tách các tế bào không bám dính ra ngoài. Sau đó bổ sung 0,4ml dung dịch HEPES 10mM pH 7,4 chứa 0,1% Triton X vào giếng để tách màng nhầy và các tế bào bám dính, trộn đều. Phần
dịch thu được thực hiện pha loãng mẫu bằng dung dịch NaCl 0,85% pH 6,5 trong 0,1% Triton X. Trang cấy trên MRS agar, nuôi ở 370C trong 48-72h để
kiểm tra mật độ tế bào bám dính trên diện tích bề mặt đĩa vi chuẩn có phủ
màng nhầy.
2.4.4.5. Xác định khả năng kháng kháng sinh
Xác định phổ tương tác với một số kháng sinh của chủng vi khuẩn lactic theo phương pháp khuếch tán kháng sinh trên đĩa thạch [49].
Nghiên cứu thử nghiệm trên 6 loại kháng sinh khác nhau: Streptomycin (Merck), Polymycin B (Merck),, Gentamycin (Merck), Amoxicillin (Merck), Penicillin (Merck), Chloramphenicol (Merck).
Tiến hành :
Nuôi cấy tĩnh các chủng vi khuẩn lactic trong môi trường MRS dịch thể ở 37 , 48h. Sau thời gian nuôi cấy, hút 100 dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic trang trên đĩa môi trường MRS agar. Đặt các khoanh giấy đã được tẩm kháng sinh lên bề mặt thạch sau khi đã trang cấy. Nuôi trong tủ ấm 37 trong vòng
48h. Đọc kết quả và xác định kích thước vòng vô khuẩn ở quanh khoanh giấy có chứa kháng sinh.
2.4.4.6. Kiểm tra khả năng ức chế một số chủng vi sinh vật gây bệnh ( theo
phương pháp của Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 1972) [3].
Cách tiến hành:
-Nuôi cấy tĩnh các chủng vi khuẩn lactic trong môi trường MRS dịch thể với ở 37 , 48h. Lấy dịch nuôi cấy đó ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/15 phút, thu dịch trong.
- Môi trường NA sau khi khử trùng để nguội khoảng 40oC, hút 1% vi khuẩn kiểm định vào, lắc đều, đổ ra đĩa petri, chờ thạch đông rồi đục lỗ thạch bằng nút khoan.
- Nhỏ 0,1ml dịch trong thu được của các mẫu nghiên cứu vào các lỗ thạch, để khuếch tán từ 4-8giờ ở 4oC. Sau đó chuyển sang tủ ấm 37oC.
Quan sát vòng kháng khuẩn sau 24 giờ.
Hoạt tính kháng khuẩn được tính bằng = D- d
Trong đó: D là đường kính vòng vô khuẩn (mm), d là đường kính lỗ thạch (mm).
2.4.4.7. Phương pháp xác định khả năng sinh acid lactic theo phương pháp của Therner[6] .
- Nuôi cấy tĩnh các chủng vi khuẩn lactic trong bình tam giác chứa 30ml môi trường MRS dịch thể ở 37 trong vòng 48h. Kết thúc thời gian nuôi cấy, thu dịch nuôi cấy li tâm với tốc độ 10000 vòng/phút, giữ lại phần dịch trong. - Lấy 10ml dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic sau khi đã li tâm pha loãng với 20ml nước cất, nhỏ thêm 2-3 giọt phenolphtalein (1% pha trong etanol 90 ) và tiến hành chuẩn độ acid lactic bằng dung dịch NaOH 0,1N. Nhỏ từ từ dung dịch NaOH 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền 30 giây thì dừng lại. Xác định thể tích NaOH đã dùng.
- Lượng acid lactic sinh ra được tính theo công thức
Hàm lượng acid lactic = Chú thích:
2.4.5.Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp cho quá trình tạo GABA và sinh khối cao của các chủng vi khuẩn lựa chọn
2.4.5.1. Lựa chọn môi trường
Nguyên tắc: Các chủng vi khuẩn lactic khác nhau có khả năng sinh trưởng trong các loại môi trường khác nhau, tạo các sản phẩm khác nhau. Việc thử khả năng sống trong các loại môi trường giúp tìm ra môi trường thích hợp cho mỗi chủng vi khuẩn để tạo sản phẩm thích hợp cho mục đích sử dụng.
Cách tiến hành:
-Nuôi cấy tĩnh 3% thể tích giống các chủng vi khuẩn lactic trong các bình tam giác chứa 30ml môi trường MRS dịch thể, môi trường cà chua, môi trường cám gạo, môi trường 18 đều đã bổ sung 5% MSG, ở 37 trong vòng 48h.
-Kết thúc thời gian nuôi cấy, tiến hành các thí nghiệm với dịch nuôi cấy: xác định khả năng sinh trưởng (đo OD600) và khả năng sinh GABA bằng phương pháp định tính và định lượng.
2.4.5.2. Lựa chọn nhiê ̣t độ nuôi cấy thích hợp
- Tương tự như tối ưu môi trường, các chủng vi khuẩn lactic được nuôi cấy trên môi trường thích hợp ở các nhiệt độ khác nhau từ 20oC đến 55oC trong vòng 48h.
- Kết thúc thời gian nuôi cấy, tiến hành các thí nghiệm với dịch nuôi cấy: xác định khả năng sinh trưởng (đo OD600) và khả năng sinh GABA bằng phương pháp định lượng.
2.4.5.3. Lựa chọn pH môi trường nuôi cấy thích hợp
Các chủ ng vi khuẩn đươ ̣c nuôi trong môi trường thích hợp, nhiê ̣t đô ̣ thích hơ ̣p, pH ban đầu của môi trường đươ ̣c chỉnh ở các giá tri ̣: 4, 5, 6, 7, 8.
Sau thờ i gian 48 giờ, xác đi ̣nh khả năng sinh trưởng (đo OD600) và khả năng sinh GABA bằng phương pháp định lượng.
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Lựa chọn chủng vi khuẩn lactic sinh tổng hợp GABA
GABA được biết là hợp chất có hoạt tính sinh học có giá trị ứng dụng trong dược phẩm, thực phẩm và mỹ phẩm như: kích thích tăng trưởng và tổng hợp protein trong não, ức chế ung thư, ngăn chặn tình trạng cao huyết áp và hạn chế bệnh đái tháo đường. Trong phần tổng quan đã đề cập đến nguồn sinh GABA đa dạng, phong phú trên các đối tượng thực vật, động vật và vi sinh vật. Đối tượng vi sinh vật sinh GABA cũng rất đa dạng như: nấm sợi
Aspergillus nidudans, Aspergillus niger hay nấm men Rhodotorula glutilis, Saccharomyces cerevisiae var boulardii, xạ khuẩn Streptomyces và vi khuẩn lactic Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus delbrueckii ssp., Lactobacillus bulgaricus, Lactococcus lactic [9]. Trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn đối tượng nghiên cứu là vi khuẩn lactic. Đây là đối tượng được biết là thuộc nhóm an toàn (GRAS). Những chủng vi khuẩn nghiên cứu sàng lọc GABA được lấy từ bộ giống vi khuẩn lactic tại Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật, Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học.
Từ 100 chủng vi khuẩn lactic ban đầu, bằng phương pháp sắc ký bản mỏng chúng tôi đã sàng lọc được 13 chủng có khả năng sinh GABA (chiếm 13%). Kết quả được thể hiện trong Bảng 3.1 và Hình 3.1:
Bảng 3.1.Kết quả sàng lọc khả năng sinh GABA của các chủng vi khuẩn
Lactobacillus
STT Kýhiệuchủng Hoạt tính
GABA Nguồn gốc phân lập
1. VTCC-B-397 + Nước dưa chua 2. VTCC-B-399 + Nước dưa chua
3. VTCC-B-411 + Nước dưa chua 4. VTCC-B-421 ++ Nước dưa chua 5. VTCC-B-423 + Nước dưa chua 6. VTCC-B-424 + Nước dưa chua 7. VTCC-B-426 ++ Nước dưa chua 8. VTCC-B-431 ++ Nước dưa chua 9. VTCC-B-433 + Nước dưa chua 10. VTCC-B-775 + Chủng trao đổi 11. VTCC-B-933 + Cỏ ủ chua 12. VTCC-B-1450 ++ Nem chua
13. ĐK405 + Nước dưa chua
Ghi chú: Chủng trao đổi là chủng vi khuẩn lactic nhận được từ sự hợp tác nghiên cứu của Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật (VTCC) với Bảo tàng giống vi sinh vật Nhật Bản ( JCM);(+): hoạt tính GABA trung bình; (++): hoạt tính GABA mạnh
Chú thích: GABA- chất chuẩn GABA; MSG- Monosodium glutamate; 421, 397, MK19.1, 423, 426, 399, 405, 433, 431, 424, 775, 411, 384, y01, 933,
1450- Kí hiệu của các chủng vi khuẩn lactic.
Từ kết quả ở Bảng 3.1 và Hình 3.1 có thể cho chúng ta nhận định rằng có 4 chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh GABA cao hơn các chủng còn lại: VTCC-B-1450, VTCC-B-421, VTCC-B-431, VTCC-B-426. Cả 4 chủng vi khuẩn nghiên cứu này được tiến hành phân loại dựa vào phân tích trình tự gen trong nghiên cứu tiếp theo.
3.2. Phân loại
3.2.1. Phân loại dựa trên phân tích trình tự rDNA
Để phân loại được các chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu, chúng tôi tiến hành tách chiết ADN của chúng, sau đó nhân đoạn gen 16S bằng cặp mồi 27F và 1525R. Trình tự đoạn gen ARNr 16S này được so sánh với trình tự gen của các loài đã biết dựa vào công cụ Blast search trên ngân hàng gen NCBI. Sau đó sử dụng phần mềm Clustal X để so sánh trình tự gen các chủng nghiên cứu với các loài có mối quan hệ họ hàng gần. Xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự ADNr 16S từ 1400bp của các chủng nghiên cứu với các loài gần gũi nhất với các loài đã biết thuộc chi Lactobacillus. Pediococcus parvulus được sử dụng làm nhóm ngoài (Hình 3.2). Kết quả trên Hình 3.2 cho thấy chủng VTCC-B-431 và chủng VTCC-B-426 nằm trên cùng một nhánh với loài Lactobacillus paracasei_ATCC334 với giá trị bootstrap 100%; chủng VTCC-B-421 nằm trên cùng một nhánh với loài Lactobacillus brevis
ATCC14869 với giá trị bootstrap 100%;; chủng VTCC-B-1450 nằm trên cùng một nhánh với loài L. buchneri AB205055 với giá trị bootstrap 60%.
Hình 3.2. Vị trí phân loại của các chủng nghiên cứu với các loài có mối quan hệ họ hàng gần
3.2.2. Hình thái của các chủng Lactobacillus nghiên cứu
3.2.2.1. Chủng VTCC-B-421
Hình thái khuẩn lạc: Sau 48 giờ nuôi cấy ở trên môi trường thạch MRS, khuẩn lạc chủng VTCC-B-421có dạng tròn, lồi, màu trắng sữa, nhẵn bóng, mép liền, đường kính 1,2 - 2 mm.
Hình thái tế bào: Chủng VTCC-B-421 nuôi trên môi trường thạch MRS trong 48 giờ, nhuộm Gram, quan sát tế bào dưới kính hiển vi vật kính 100X: tế bào Gram dương, có dạng que ngắn, kích thước (0,62-0,91) x (0,88- 1,16) μm.
Pediococcus parvulus D88528
Lactobacillus acidilactici_EF059987
Lactobacillus malefermentans_AM113783/ DSM 5705
Lactobacillus paraplantarum_AJ306297/ DSM 10667T
Lactobacillus pentosus_D79211
Lactobacillus versmoldensis_AJ496791/KU-3T 100
Lactobacillus vaccinostercus_AJ621556/ LMG 9215T 64
80
Lactobacillus paracasei CP000423/ATCC334 VTCC-B-431
VTCC-B-426 100
Lactobacillus acidifarinae_AJ632158/ LMG 22200
Lactobacillus brevis_M58810/ ATCC 14869 VTCC-B-421
100
Lactobacillus parafarraginis AB262734/NRIC 0677
Lactobacillus diolivorans AF26470/JKD6
Lactobacillus kisonensis AB366388/JCM 1504
Lactobacillus rapi AB366389/ JCM 15042 61
Lactobacillus parakefiri AY026750 VTCC-B-1450
Lactobacillus buchneri AB205055 79
Lactobacillus sunkii AB366385/JCM 15039
Lactobacillus kefiri AJ621553/ LMG 9480T
Lactobacillus parabuchneri_AB205056 60 53 64 81 100 100 6 3 80 0.01 Pediococcus parvulus D88528
Lactobacillus acidilactici_EF059987
Lactobacillus malefermentans_AM113783/ DSM 5705
Lactobacillus paraplantarum_AJ306297/ DSM 10667T
Lactobacillus pentosus_D79211
Lactobacillus versmoldensis_AJ496791/KU-3T 100
Lactobacillus vaccinostercus_AJ621556/ LMG 9215T 64
80
Lactobacillus paracasei CP000423/ATCC334 VTCC-B-431
VTCC-B-426 100
Lactobacillus acidifarinae_AJ632158/ LMG 22200
Lactobacillus brevis_M58810/ ATCC 14869 VTCC-B-421
100
Lactobacillus parafarraginis AB262734/NRIC 0677
Lactobacillus diolivorans AF26470/JKD6
Lactobacillus kisonensis AB366388/JCM 1504
Lactobacillus rapi AB366389/ JCM 15042 61
Lactobacillus parakefiri AY026750 VTCC-B-1450
Lactobacillus buchneri AB205055 79
Lactobacillus sunkii AB366385/JCM 15039
Lactobacillus kefiri AJ621553/ LMG 9480T
Lactobacillus parabuchneri_AB205056 60 53 64 81 100 100 6 3 80 0.01
A B
Hình 3.3: Hình thái khuẩn lạc (A) và tế bào (B) của chủngVTCC-B-421
3.2.2.2. Chủng VTCC-B-426
Hình thái khuẩn lạc: Sau 48 giờ nuôi cấy ở trên môi trường thạch MRS, khuẩn lạc chủng VTCC-B-426 có dạng tròn, lồi, màu trắng, bóng ướt, mép liền, đường kính 1,0-1,3mm.
Hình thái tế bào: Chủng VTCC-B-426 nuôi trên môi trường thạch MRS trong 48 giờ, nhuộm Gram, quan sát tế bào dưới kính hiển vi vật kính 100X: tế bào Gram dương, có dạng que ngắn, kích thước (0,72-0,92) × (1,22- 1,41) µm.
A B
3.2.2.3. Chủng VTCC-B-431
Hình thái khuẩn lạc: Sau 48 giờ nuôi cấy ở trên môi trường thạch MRS, khuẩn lạc chủng VTCC-B-431có dạng tròn, lồi, màu trắng, bóng ướt, mép liền, đường kính 1,0-1,3mm.
Hình thái tế bào: Chủng VTCC-B-431 nuôi trên môi trường thạch MRS trong 48 giờ nhuộm Gram, quan sát tế bào dưới kính hiển vi vật kính 100X: tế bào Gram dương, có dạng hình que ngắn, kích thước (0,75-0,98) × (1,19-1,31) µm.
A B
Hình 3.5: Hình thái khuẩn lạc (A) và tế bào (B) của chủngVTCC-B-431
3.2.2.4. Chủng VTCC-B-1450
Hình thái khuẩn lạc: Sau 48 giờ nuôi cấy ở trên môi trường thạch MRS, khuẩn lạc chủng VTCC-B-1450 có dạng hơi tròn, hơi lồi, màu trắng sữa, bóng ướt, mép răng cưa, đường kính 1,2-1,5mm.
Hình thái tế bào: Chủng VTCC-B-1450 nuôi trên môi trường thạch MRS trong 48 giờ, nhuộm Gram, quan sát tế bào dưới kính hiển vi vật kính 100X: tế bào Gram dương, có dạng hình que ngắn, kích thước (0,65-0,87) × (0,97-1,11) µm.
A B
Hình 3.6: Hình thái khuẩn lạc (A) và tế bào (B) của chủngVTCC-B-1450 Việc định danh các chủng vi khuẩn cần sự kết hợp các nghiên cứu (i) đặc tính sinh học truyền thống: hình thái tế bào, khuẩn lạc (màu sắc, kích thước, hình dáng), đặc điểm nuôi cấy, đặc tính sinh lý, sinh hóa (lên men, kỵ khí, hiếu khí, lên men các nguồn các bon, nitơ, sinh các enzyme khác nhau) và (ii) các kết quả phân tích hiện đại như giải trình tự rADN 16s, hóa phân loại (phân tích thành phần thành tế bào, các loại đường, a xit béo, hệ thống vận chuyển điện tử (ubiquinone, menaquinone) …. Trong nghiên cứu này chúng tôi mới chỉ phân tích được trình tự rADN 16s và hình thái tế bào,