Vi sinh vật được nhuộm gram theo “Gram stain protocols” của Smith và cs[58]. Quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi và sử dụng khóa phân loại theo Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology[58]:
A. Các bước nhuộm Gram
- Chuẩn bị lam kính sạch, rửa bằng nước cất vô trùng và làm khô bằng thổi gió trong bốc cấy
- Cố định tế bào vi khuẩn bằng hơi nóng của ngọn lửa đèn cồn
- Nhỏ dung dịch tím kết tinh (1 phút)
- Rửa nhẹ tiêu bản bằng vòi nước, sau đó nhuộm với Iodine trong vòng 1 phút.
- Rửa nhẹ iodine thừa bằng nước, sau đó tẩy màu bằng Aceton hoặc 95% cồn, khoảng 5 giây cho đến khi tiêu bản gần có màu trong, thời gian phụ thuộc vào độ dầy đặc của mẫu (Màu tím đen).
- Rửa tiêu bản ngay lập tức cồn bằng nước, sau khi tẩy cồn. Những vi sinh vật là Gram âm sẽ không nhìn thấy trên tiêu bản.
- Nhỏ Safranin, để 30-45 giây
Safranin, tế bào có màu đỏ hồng. Lưu ý bước làm khô tiêu bản, rồi mới soi là rất quan trọng, vì nếu tiêu bản chưa khô, nếu soi ngay ở vật kính dầu, thì các tế bào sẽ không sắc nét, khó quan sát hình ảnh đặc trưng của tế bào.
Kết quả: Tế bào bắt màu tím là Gram dương; còn màu đỏ là Gram âm.
B. Cách pha các dung dịch nhuộm Gram
1. Crystal violet (Thuốc tím)
Dung dịch A: Tím kết tinh (Crystal Violet 90%)-2g ; Cồn (Ethyl Alcohol 95%)- 20.0 ml.
Dung dịch B: Ammoniumoxalate-0.8g; Nước cất -80.0 ml
Lưu ý: Sau khi pha riêng 2 dung dịch trên, trộn dung dịch A và B vào nhau để tạo thành thuốc tím.
2. Gram’s iodine (I-ốt)
Iodine-1.0 g; Potasium Iodine (KI)-2.0 g; Nước cất-100.0 ml.
Cách pha dung dịch i-ốt đậm đặc hơn làm cho việc phân biệt vi khuẩn Gram dương (tím đen) và Gram âm (tế bào có mầu hồng rực) rõ ràng hơn.
3. Cồn (Ethyl Alcohol 95%)
Ethyl Alcohol (100%)-95.0 ml; Nước cất-5.0 ml
4. Safranin
Safranin O-0.25g; Ethyl Alcohol (95.0%)-10.0ml; Nước cất-1000.0 ml