phương pháp của Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 1972) [3].
Cách tiến hành:
-Nuôi cấy tĩnh các chủng vi khuẩn lactic trong môi trường MRS dịch thể với ở 37 , 48h. Lấy dịch nuôi cấy đó ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/15 phút, thu dịch trong.
- Môi trường NA sau khi khử trùng để nguội khoảng 40oC, hút 1% vi khuẩn kiểm định vào, lắc đều, đổ ra đĩa petri, chờ thạch đông rồi đục lỗ thạch bằng nút khoan.
- Nhỏ 0,1ml dịch trong thu được của các mẫu nghiên cứu vào các lỗ thạch, để khuếch tán từ 4-8giờ ở 4oC. Sau đó chuyển sang tủ ấm 37oC.
Quan sát vòng kháng khuẩn sau 24 giờ.
Hoạt tính kháng khuẩn được tính bằng = D- d
Trong đó: D là đường kính vòng vô khuẩn (mm), d là đường kính lỗ thạch (mm).
2.4.4.7. Phương pháp xác định khả năng sinh acid lactic theo phương pháp của Therner[6] .
- Nuôi cấy tĩnh các chủng vi khuẩn lactic trong bình tam giác chứa 30ml môi trường MRS dịch thể ở 37 trong vòng 48h. Kết thúc thời gian nuôi cấy, thu dịch nuôi cấy li tâm với tốc độ 10000 vòng/phút, giữ lại phần dịch trong. - Lấy 10ml dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic sau khi đã li tâm pha loãng với 20ml nước cất, nhỏ thêm 2-3 giọt phenolphtalein (1% pha trong etanol 90 ) và tiến hành chuẩn độ acid lactic bằng dung dịch NaOH 0,1N. Nhỏ từ từ dung dịch NaOH 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền 30 giây thì dừng lại. Xác định thể tích NaOH đã dùng.
- Lượng acid lactic sinh ra được tính theo công thức
Hàm lượng acid lactic = Chú thích:
2.4.5.Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp cho quá trình tạo GABA và sinh khối cao của các chủng vi khuẩn lựa chọn
2.4.5.1. Lựa chọn môi trường
Nguyên tắc: Các chủng vi khuẩn lactic khác nhau có khả năng sinh trưởng trong các loại môi trường khác nhau, tạo các sản phẩm khác nhau. Việc thử khả năng sống trong các loại môi trường giúp tìm ra môi trường thích hợp cho mỗi chủng vi khuẩn để tạo sản phẩm thích hợp cho mục đích sử dụng.
Cách tiến hành:
-Nuôi cấy tĩnh 3% thể tích giống các chủng vi khuẩn lactic trong các bình tam giác chứa 30ml môi trường MRS dịch thể, môi trường cà chua, môi trường cám gạo, môi trường 18 đều đã bổ sung 5% MSG, ở 37 trong vòng 48h.
-Kết thúc thời gian nuôi cấy, tiến hành các thí nghiệm với dịch nuôi cấy: xác định khả năng sinh trưởng (đo OD600) và khả năng sinh GABA bằng phương pháp định tính và định lượng.
2.4.5.2. Lựa chọn nhiê ̣t độ nuôi cấy thích hợp
- Tương tự như tối ưu môi trường, các chủng vi khuẩn lactic được nuôi cấy trên môi trường thích hợp ở các nhiệt độ khác nhau từ 20oC đến 55oC trong vòng 48h.
- Kết thúc thời gian nuôi cấy, tiến hành các thí nghiệm với dịch nuôi cấy: xác định khả năng sinh trưởng (đo OD600) và khả năng sinh GABA bằng phương pháp định lượng.
2.4.5.3. Lựa chọn pH môi trường nuôi cấy thích hợp
Các chủ ng vi khuẩn đươ ̣c nuôi trong môi trường thích hợp, nhiê ̣t đô ̣ thích hơ ̣p, pH ban đầu của môi trường đươ ̣c chỉnh ở các giá tri ̣: 4, 5, 6, 7, 8.
Sau thờ i gian 48 giờ, xác đi ̣nh khả năng sinh trưởng (đo OD600) và khả năng sinh GABA bằng phương pháp định lượng.
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Lựa chọn chủng vi khuẩn lactic sinh tổng hợp GABA
GABA được biết là hợp chất có hoạt tính sinh học có giá trị ứng dụng trong dược phẩm, thực phẩm và mỹ phẩm như: kích thích tăng trưởng và tổng hợp protein trong não, ức chế ung thư, ngăn chặn tình trạng cao huyết áp và hạn chế bệnh đái tháo đường. Trong phần tổng quan đã đề cập đến nguồn sinh GABA đa dạng, phong phú trên các đối tượng thực vật, động vật và vi sinh vật. Đối tượng vi sinh vật sinh GABA cũng rất đa dạng như: nấm sợi
Aspergillus nidudans, Aspergillus niger hay nấm men Rhodotorula glutilis, Saccharomyces cerevisiae var boulardii, xạ khuẩn Streptomyces và vi khuẩn lactic Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus delbrueckii ssp., Lactobacillus bulgaricus, Lactococcus lactic [9]. Trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn đối tượng nghiên cứu là vi khuẩn lactic. Đây là đối tượng được biết là thuộc nhóm an toàn (GRAS). Những chủng vi khuẩn nghiên cứu sàng lọc GABA được lấy từ bộ giống vi khuẩn lactic tại Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật, Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học.
Từ 100 chủng vi khuẩn lactic ban đầu, bằng phương pháp sắc ký bản mỏng chúng tôi đã sàng lọc được 13 chủng có khả năng sinh GABA (chiếm 13%). Kết quả được thể hiện trong Bảng 3.1 và Hình 3.1:
Bảng 3.1.Kết quả sàng lọc khả năng sinh GABA của các chủng vi khuẩn
Lactobacillus
STT Kýhiệuchủng Hoạt tính
GABA Nguồn gốc phân lập
1. VTCC-B-397 + Nước dưa chua 2. VTCC-B-399 + Nước dưa chua
3. VTCC-B-411 + Nước dưa chua 4. VTCC-B-421 ++ Nước dưa chua 5. VTCC-B-423 + Nước dưa chua 6. VTCC-B-424 + Nước dưa chua 7. VTCC-B-426 ++ Nước dưa chua 8. VTCC-B-431 ++ Nước dưa chua 9. VTCC-B-433 + Nước dưa chua 10. VTCC-B-775 + Chủng trao đổi 11. VTCC-B-933 + Cỏ ủ chua 12. VTCC-B-1450 ++ Nem chua
13. ĐK405 + Nước dưa chua
Ghi chú: Chủng trao đổi là chủng vi khuẩn lactic nhận được từ sự hợp tác nghiên cứu của Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật (VTCC) với Bảo tàng giống vi sinh vật Nhật Bản ( JCM);(+): hoạt tính GABA trung bình; (++): hoạt tính GABA mạnh
Chú thích: GABA- chất chuẩn GABA; MSG- Monosodium glutamate; 421, 397, MK19.1, 423, 426, 399, 405, 433, 431, 424, 775, 411, 384, y01, 933,
1450- Kí hiệu của các chủng vi khuẩn lactic.
Từ kết quả ở Bảng 3.1 và Hình 3.1 có thể cho chúng ta nhận định rằng có 4 chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh GABA cao hơn các chủng còn lại: VTCC-B-1450, VTCC-B-421, VTCC-B-431, VTCC-B-426. Cả 4 chủng vi khuẩn nghiên cứu này được tiến hành phân loại dựa vào phân tích trình tự gen trong nghiên cứu tiếp theo.
3.2. Phân loại
3.2.1. Phân loại dựa trên phân tích trình tự rDNA
Để phân loại được các chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu, chúng tôi tiến hành tách chiết ADN của chúng, sau đó nhân đoạn gen 16S bằng cặp mồi 27F và 1525R. Trình tự đoạn gen ARNr 16S này được so sánh với trình tự gen của các loài đã biết dựa vào công cụ Blast search trên ngân hàng gen NCBI. Sau đó sử dụng phần mềm Clustal X để so sánh trình tự gen các chủng nghiên cứu với các loài có mối quan hệ họ hàng gần. Xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự ADNr 16S từ 1400bp của các chủng nghiên cứu với các loài gần gũi nhất với các loài đã biết thuộc chi Lactobacillus. Pediococcus parvulus được sử dụng làm nhóm ngoài (Hình 3.2). Kết quả trên Hình 3.2 cho thấy chủng VTCC-B-431 và chủng VTCC-B-426 nằm trên cùng một nhánh với loài Lactobacillus paracasei_ATCC334 với giá trị bootstrap 100%; chủng VTCC-B-421 nằm trên cùng một nhánh với loài Lactobacillus brevis
ATCC14869 với giá trị bootstrap 100%;; chủng VTCC-B-1450 nằm trên cùng một nhánh với loài L. buchneri AB205055 với giá trị bootstrap 60%.
Hình 3.2. Vị trí phân loại của các chủng nghiên cứu với các loài có mối quan hệ họ hàng gần
3.2.2. Hình thái của các chủng Lactobacillus nghiên cứu
3.2.2.1. Chủng VTCC-B-421
Hình thái khuẩn lạc: Sau 48 giờ nuôi cấy ở trên môi trường thạch MRS, khuẩn lạc chủng VTCC-B-421có dạng tròn, lồi, màu trắng sữa, nhẵn bóng, mép liền, đường kính 1,2 - 2 mm.
Hình thái tế bào: Chủng VTCC-B-421 nuôi trên môi trường thạch MRS trong 48 giờ, nhuộm Gram, quan sát tế bào dưới kính hiển vi vật kính 100X: tế bào Gram dương, có dạng que ngắn, kích thước (0,62-0,91) x (0,88- 1,16) μm.
Pediococcus parvulus D88528
Lactobacillus acidilactici_EF059987
Lactobacillus malefermentans_AM113783/ DSM 5705
Lactobacillus paraplantarum_AJ306297/ DSM 10667T
Lactobacillus pentosus_D79211
Lactobacillus versmoldensis_AJ496791/KU-3T 100
Lactobacillus vaccinostercus_AJ621556/ LMG 9215T 64
80
Lactobacillus paracasei CP000423/ATCC334 VTCC-B-431
VTCC-B-426 100
Lactobacillus acidifarinae_AJ632158/ LMG 22200
Lactobacillus brevis_M58810/ ATCC 14869 VTCC-B-421
100
Lactobacillus parafarraginis AB262734/NRIC 0677
Lactobacillus diolivorans AF26470/JKD6
Lactobacillus kisonensis AB366388/JCM 1504
Lactobacillus rapi AB366389/ JCM 15042 61
Lactobacillus parakefiri AY026750 VTCC-B-1450
Lactobacillus buchneri AB205055 79
Lactobacillus sunkii AB366385/JCM 15039
Lactobacillus kefiri AJ621553/ LMG 9480T
Lactobacillus parabuchneri_AB205056 60 53 64 81 100 100 6 3 80 0.01 Pediococcus parvulus D88528
Lactobacillus acidilactici_EF059987
Lactobacillus malefermentans_AM113783/ DSM 5705
Lactobacillus paraplantarum_AJ306297/ DSM 10667T
Lactobacillus pentosus_D79211
Lactobacillus versmoldensis_AJ496791/KU-3T 100
Lactobacillus vaccinostercus_AJ621556/ LMG 9215T 64
80
Lactobacillus paracasei CP000423/ATCC334 VTCC-B-431
VTCC-B-426 100
Lactobacillus acidifarinae_AJ632158/ LMG 22200
Lactobacillus brevis_M58810/ ATCC 14869 VTCC-B-421
100
Lactobacillus parafarraginis AB262734/NRIC 0677
Lactobacillus diolivorans AF26470/JKD6
Lactobacillus kisonensis AB366388/JCM 1504
Lactobacillus rapi AB366389/ JCM 15042 61
Lactobacillus parakefiri AY026750 VTCC-B-1450
Lactobacillus buchneri AB205055 79
Lactobacillus sunkii AB366385/JCM 15039
Lactobacillus kefiri AJ621553/ LMG 9480T
Lactobacillus parabuchneri_AB205056 60 53 64 81 100 100 6 3 80 0.01
A B
Hình 3.3: Hình thái khuẩn lạc (A) và tế bào (B) của chủngVTCC-B-421
3.2.2.2. Chủng VTCC-B-426
Hình thái khuẩn lạc: Sau 48 giờ nuôi cấy ở trên môi trường thạch MRS, khuẩn lạc chủng VTCC-B-426 có dạng tròn, lồi, màu trắng, bóng ướt, mép liền, đường kính 1,0-1,3mm.
Hình thái tế bào: Chủng VTCC-B-426 nuôi trên môi trường thạch MRS trong 48 giờ, nhuộm Gram, quan sát tế bào dưới kính hiển vi vật kính 100X: tế bào Gram dương, có dạng que ngắn, kích thước (0,72-0,92) × (1,22- 1,41) µm.
A B
3.2.2.3. Chủng VTCC-B-431
Hình thái khuẩn lạc: Sau 48 giờ nuôi cấy ở trên môi trường thạch MRS, khuẩn lạc chủng VTCC-B-431có dạng tròn, lồi, màu trắng, bóng ướt, mép liền, đường kính 1,0-1,3mm.
Hình thái tế bào: Chủng VTCC-B-431 nuôi trên môi trường thạch MRS trong 48 giờ nhuộm Gram, quan sát tế bào dưới kính hiển vi vật kính 100X: tế bào Gram dương, có dạng hình que ngắn, kích thước (0,75-0,98) × (1,19-1,31) µm.
A B
Hình 3.5: Hình thái khuẩn lạc (A) và tế bào (B) của chủngVTCC-B-431
3.2.2.4. Chủng VTCC-B-1450
Hình thái khuẩn lạc: Sau 48 giờ nuôi cấy ở trên môi trường thạch MRS, khuẩn lạc chủng VTCC-B-1450 có dạng hơi tròn, hơi lồi, màu trắng sữa, bóng ướt, mép răng cưa, đường kính 1,2-1,5mm.
Hình thái tế bào: Chủng VTCC-B-1450 nuôi trên môi trường thạch MRS trong 48 giờ, nhuộm Gram, quan sát tế bào dưới kính hiển vi vật kính 100X: tế bào Gram dương, có dạng hình que ngắn, kích thước (0,65-0,87) × (0,97-1,11) µm.
A B
Hình 3.6: Hình thái khuẩn lạc (A) và tế bào (B) của chủngVTCC-B-1450 Việc định danh các chủng vi khuẩn cần sự kết hợp các nghiên cứu (i) đặc tính sinh học truyền thống: hình thái tế bào, khuẩn lạc (màu sắc, kích thước, hình dáng), đặc điểm nuôi cấy, đặc tính sinh lý, sinh hóa (lên men, kỵ khí, hiếu khí, lên men các nguồn các bon, nitơ, sinh các enzyme khác nhau) và (ii) các kết quả phân tích hiện đại như giải trình tự rADN 16s, hóa phân loại (phân tích thành phần thành tế bào, các loại đường, a xit béo, hệ thống vận chuyển điện tử (ubiquinone, menaquinone) …. Trong nghiên cứu này chúng tôi mới chỉ phân tích được trình tự rADN 16s và hình thái tế bào, khuẩn lạc của 4 chủng nghiên cứu. Kết quả so sánh trình tự rADN 16s và hình thái tế bào khuẩn lạc của 4 chủng cho thấy: chủng VTCC-B-1450 giống với loài Lactobacillus buchneri, chủng VTCC-B-421 giống với loài L.brevis, 2 chủng VTCC-B-431 và VTCC-B-426 giống với loài L.paracasei. Các đại diện thuộc 3 loài nghiên cứu cũng là các đối tượng nghiên cứu có khả năng tổng hợp GABA cao từ một số nghiên cứu trước đây [11],[33], [40].
3.3. Xác định các đặc tính probiotics của các chủng vi khuẩn lactic
Sau khi tuyển chọn được các chủng sinh GABA cao và tiến hành định danh các chủng vi khuẩn lựa chọn, kết quả cho thấy đây là các chủng vi khuẩn lactic an toàn và thường được sử dụng trong thực phẩm.Vì vậy chúng
tôi thấy rằng cần thiết phải đánh giá khả năng probiotic của chủng giống để ứng dụng những đặc tính có lợi của chủng vào sản xuất thực phẩm chức năng giàu hoạt tính sinh học.
Những chủng vi khuẩn lactic có thể được ứng dụng làm probiotic hay không phụ thuộc vào khả năng sống sót của chúng trong dịch dạ dày và dịch mật. Dịch dạ dày có pH rất thấp (pH=2-3), trong khi dịch mật có nồng độ muối mật cao là những điều kiện khắc nghiệt đối với các vi sinh vật. Vì vậy chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm khảo sát khả năng probiotic của chủng qua các tiêu chí: khả năng chịu acid, khả năng chịu muối mật, khả năng tồn tại trong môi trường dạ dày và dịch ruột giả lập, khả năng bám dính trên màng nhầy ruột, khả năng tương tác với một số kháng sinh và khả năng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh, khả năng sinh acid lactic.
3.3.1. Kết quả xác định khả năng sinh trưởng trong môi trường có pH thấp
Khả năng chịu được acid là một trong những đặc tính cần có của một chủng được xem là có hoạt tính probiotic, vì nó giúp cho vi khuẩn có thể tồn tại và sống sót được khi qua hệ tiêu hóa của người như dạ dày để đi đến ruột và sau đó phát triển mang lại những lợi ích nhất định chủ yếu tại vùng ruột.
Chúng tôi tiến hành nuôi 4 chủng vi khuẩn lactic trong môi trường MRS dịch thể ở các giá trị pH ban đầu là: 2, 3, 4, 5, 6. Kết thúc thời gian nuôi cấy, tiến hành đo OD để xác định khả năng sinh trưởng và thu được hết quả trong Hình 3.7:
Hình 3.7: Khả năng sinh trưởng trong môi trường có pH thấp của 4 chủng vi khuẩn
Từ kết quả ở Hình 3.7, chúng tôi nhận thấy: pH 5-6 thích hợp cho sự sinh trưởng của 4 chủng vi khuẩn (OD≥2). Ở pH≤4 sinh trưởng của 4 chủng đều giảm mạnh. Cả 4 chủng nghiên cứu đều có khả năng sinh trưởng trong môi trường có pH thấp, ở pH = 2 chúng vẫn có khả năng tồn tại và có khả năng sống sót trong dạ dày người ( có pH 2- 3). Nói cách khác, chúng có năng chống chịu với điều kiện acid của dạ dày để đi đến ruột non. Kết quả này cũng trùng với kết quả của Đào Thị Lương và cộng sự khi nghiên cứu khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn lactic (2010) [5].
3.3.2. Kết quả xác định khả năng sinh trưởng trong môi trường có bổ sung muối mật
Chúng tôi tiến hành nuôi 4 chủng vi khuẩn lactic trong môi trường MRS dịch thể đã được bổ sung muối mật với các nồng độ khác nhau: 0,05%,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%. Kết thúc thời gian nuôi cấy, tiến hành đo OD để xác định khả năng sinh trưởng và thu được hết quả trong Hình 3.8:
Hình 3.8: Khả năng sinh trưởng trong môi trường có bổ sung muối mật của 4 chủng vi khuẩn
Kết quả ở Hình 3.8 cho thấy sự sinh trưởng của 4 chủng đều giảm
mạnh ở hàm lượng muối mật ≥0,1% nhưng cả 4 chủng đều tồn tại được ở nồng độ muối mật từ 0,1- 0,3%. Khả năng chịu muối mật có liên quan tới khả năng sống sót của vi khuẩn trong đường tiêu hóa của con người do muối mật là một thành phần có trong ruột, giúp tiêu hóa thức ăn. Vi khuẩn lactic sống trong ruột của con người khi có khả năng chịu được muối mật sẽ sống sót và
tiếp tục sinh trưởng. Kết quả này cũng trùng với kết quả của Balasingham khi
nghiên cứu trên L. plantarum và L. acidophilus (2017)[8].
3.3.3. Khả năng sống sót trong dịch dạ dày và dịch ruột giả lập
Vi khuẩn probiotic trong ruột non và ruột già tham gia hoàn thành nốt
quá trình tiêu hóa. Do vậy chúng phải có khả năng chịu được dịch dạ dày và dịch mật để đến cư trú tại đường ruột. Theo Holzapfel và cs(1998), pH thấp