Sau khi tuyển chọn được các chủng sinh GABA cao và tiến hành định danh các chủng vi khuẩn lựa chọn, kết quả cho thấy đây là các chủng vi khuẩn lactic an toàn và thường được sử dụng trong thực phẩm.Vì vậy chúng
tôi thấy rằng cần thiết phải đánh giá khả năng probiotic của chủng giống để ứng dụng những đặc tính có lợi của chủng vào sản xuất thực phẩm chức năng giàu hoạt tính sinh học.
Những chủng vi khuẩn lactic có thể được ứng dụng làm probiotic hay không phụ thuộc vào khả năng sống sót của chúng trong dịch dạ dày và dịch mật. Dịch dạ dày có pH rất thấp (pH=2-3), trong khi dịch mật có nồng độ muối mật cao là những điều kiện khắc nghiệt đối với các vi sinh vật. Vì vậy chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm khảo sát khả năng probiotic của chủng qua các tiêu chí: khả năng chịu acid, khả năng chịu muối mật, khả năng tồn tại trong môi trường dạ dày và dịch ruột giả lập, khả năng bám dính trên màng nhầy ruột, khả năng tương tác với một số kháng sinh và khả năng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh, khả năng sinh acid lactic.
3.3.1. Kết quả xác định khả năng sinh trưởng trong môi trường có pH thấp
Khả năng chịu được acid là một trong những đặc tính cần có của một chủng được xem là có hoạt tính probiotic, vì nó giúp cho vi khuẩn có thể tồn tại và sống sót được khi qua hệ tiêu hóa của người như dạ dày để đi đến ruột và sau đó phát triển mang lại những lợi ích nhất định chủ yếu tại vùng ruột.
Chúng tôi tiến hành nuôi 4 chủng vi khuẩn lactic trong môi trường MRS dịch thể ở các giá trị pH ban đầu là: 2, 3, 4, 5, 6. Kết thúc thời gian nuôi cấy, tiến hành đo OD để xác định khả năng sinh trưởng và thu được hết quả trong Hình 3.7:
Hình 3.7: Khả năng sinh trưởng trong môi trường có pH thấp của 4 chủng vi khuẩn
Từ kết quả ở Hình 3.7, chúng tôi nhận thấy: pH 5-6 thích hợp cho sự sinh trưởng của 4 chủng vi khuẩn (OD≥2). Ở pH≤4 sinh trưởng của 4 chủng đều giảm mạnh. Cả 4 chủng nghiên cứu đều có khả năng sinh trưởng trong môi trường có pH thấp, ở pH = 2 chúng vẫn có khả năng tồn tại và có khả năng sống sót trong dạ dày người ( có pH 2- 3). Nói cách khác, chúng có năng chống chịu với điều kiện acid của dạ dày để đi đến ruột non. Kết quả này cũng trùng với kết quả của Đào Thị Lương và cộng sự khi nghiên cứu khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn lactic (2010) [5].
3.3.2. Kết quả xác định khả năng sinh trưởng trong môi trường có bổ sung muối mật
Chúng tôi tiến hành nuôi 4 chủng vi khuẩn lactic trong môi trường MRS dịch thể đã được bổ sung muối mật với các nồng độ khác nhau: 0,05%,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%. Kết thúc thời gian nuôi cấy, tiến hành đo OD để xác định khả năng sinh trưởng và thu được hết quả trong Hình 3.8:
Hình 3.8: Khả năng sinh trưởng trong môi trường có bổ sung muối mật của 4 chủng vi khuẩn
Kết quả ở Hình 3.8 cho thấy sự sinh trưởng của 4 chủng đều giảm
mạnh ở hàm lượng muối mật ≥0,1% nhưng cả 4 chủng đều tồn tại được ở nồng độ muối mật từ 0,1- 0,3%. Khả năng chịu muối mật có liên quan tới khả năng sống sót của vi khuẩn trong đường tiêu hóa của con người do muối mật là một thành phần có trong ruột, giúp tiêu hóa thức ăn. Vi khuẩn lactic sống trong ruột của con người khi có khả năng chịu được muối mật sẽ sống sót và
tiếp tục sinh trưởng. Kết quả này cũng trùng với kết quả của Balasingham khi
nghiên cứu trên L. plantarum và L. acidophilus (2017)[8].
3.3.3. Khả năng sống sót trong dịch dạ dày và dịch ruột giả lập
Vi khuẩn probiotic trong ruột non và ruột già tham gia hoàn thành nốt
quá trình tiêu hóa. Do vậy chúng phải có khả năng chịu được dịch dạ dày và dịch mật để đến cư trú tại đường ruột. Theo Holzapfel và cs(1998), pH thấp
cản hữu hiệu chống lại sự xâm nhiễm của các vi khuẩn vào đường tiêu hóa
[25].
Theo Ting Qiu và cs (2010), probiotic chỉ phát huy tác dụng có lợi lên vật chủ khi chúng định cư và tồn tại trong ruột non. Môi trường ruột non chứa pancreatine và muối mật là các yếu tố ức chế sinh trưởng của vi sinh vật và nồng độ muối mật 0,3% được xem là nồng độ quyết định để sàng lọc các chủng vi sinh vật có khả năng chống chịu muối mật[49].
Khả năng sống sót của 4 chủng vi khuẩn trong dịch dạ dày và dịch ruột giả lập được đánh giá bởi sự giảm mật độ tế bào trong dịch dạ dày giả lập trong thời gian 120 phút và trong dịch ruột giả lập là 240 phút. Chúng tôi chọn thời gian 120 phút trong dịch dạ dày giả lập và 240 phút trong dịch ruột giả lập vì đây là thời gian tương ứng với sự di chuyển của thức ăn (từ khi đưa vào cơ thể bằng đường ăn uống) tới dạ dày và ruột non. Kết quả được thể hiện ở Bảng 3.2.
Bảng 3.2: Khả năng sống sót trong dịch dạ dày và dịch ruột giả lập của 4 chủng vi khuẩn. Ký hiệu chủng Khả năng sống trong dịch dạ dày Khả năng sống trong dịch ruột 0 phút (CFU/ml) 120 phút (CFU/ml) 0 phút (CFU/ml) 240 phút (CFU/ml) VTCC-B-421 2,56 x109 3,54 x107 2,67x109 8,32x108 VTCC-B-431 3,27 x109 2,34 x107 3,19 x109 1,36 x109 VTCC-B-426 3,07 x109 1,12 x107 2,89 x109 9,03x108 VTCC-B-1450 2,74 x109 1,16 x107 2,80 x109 8,58 x108
Kết quả Bảng 3.2 cho thấy, khi vi sinh vật đi vào dịch dạ dày, do pH trong môi trường dạ dày thấp nên làm giảm một số lượng khá lớn tế bào vi sinh vật: cả 4 chủng từ 109(CFU/ml) giảm xuống còn 107 (CFU/ml) sau thời gian 120 phút.
Sau khi vi sinh vật qua dạ dày rồi tiếp tục di chuyển xuống dịch ruột, lúc này môi trường có nồng độ muối mật khá cao. Sau khi khảo sát chúng tôi nhận thấy, cả 4 chủng đều chịu muối mật khá tốt, mật độ tế bào giảm không đáng kể, vẫn đạt 108-109(CFU/ml). So sánh với kết quả của tác giả Dương Minh Khải (2013)[4], chúng tôi thấy rằng chủng VTCC-B-431 có khả năng sống trong dịch ruột rất tốt, sau 240 phút vẫn đạt 1,36 x109(CFU/ml).
3.3.4. Khả năng bám dính trên màng nhầy ruột in vitro
Vi khuẩn probiotic có khả năng bám dính vào màng nhầy ruột phủ lên lớp tế bào biểu mô ở ruột, ngăn chặn sự bám dính của vi sinh vật gây bệnh với biểu bì ruột. Vì vậy probiotic có tác dụng giảm nhiễm trùng và giảm dị ứng với kháng nguyên trong thực phẩm, tăng cường hệ miễn dịch màng nhầy và mô bạch huyết liên quan đến màng nhầy. Do đó, để xác định vi khuẩn có tiềm năng làm probiotic, cần đánh giá khả năng bám dính của chúng lên màng nhầy ruột. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.3.
Bảng 3.3: Khả năng bám dính trên màng nhầy ruột in vitro của 4 chủng vi khuẩn Ký hiệu chủng Mật độ tế bào ban đầu (CFU/ml) Mật độ tế bào bám dính (CFU/ml) Tỷ lệ tế bào bám dính (%) VTCC-B-421 2,54x109 2,30x108 9,05 VTCC-B-431 3,56x109 6,15 x108 17,27 VTCC-B-426 2,87x109 4,42 x108 15,40 VTCC-B-1450 1,22 x109 1,80 x108 14,75
Từ kết quả ở bảng 3.3, chúng tôi nhận thấy khả năng bám dính của cả 4 chủng đều khá tốt, mật độ tế bào ban đầu của dịch sinh khối phủ giếng đều đạt 109CFU/ml, sau 60 phút tại 370C, mật độ tế bào bám dính trên niêm mạc ruột của cả 4 chủng đều đạt 108CFU/ml, trong đó chủng VTCC-B-431có tỷ lệ bám dính cao nhất đạt 17,27%. So sánh với chủng L.plantarum 0-17 của tác giả Nguyễn La Anh chỉ đạt tỷ lệ 14,94% [1], chúng tôi thấy rằng 3 chủng VTCC- B-431,VTCC-B-426, VTCC-B-1450 đều có khả năng bám dính tốt hơn.
3.3.5. Kết quả xác định khả năng kháng kháng sinh
Các chủng vi khuẩn tương tác với các loại kháng sinh ở các mức độ khác nhau từ nhạy cảm, trung bình và đến mức bền (kháng). Sự tương tác của các chủng vi khuẩn với kháng sinh cần được nghiên cứu để có thể dự đoán, đánh giá được sự ảnh hưởng của vi khuẩn probiotic với tác dụng kháng sinh trị liệu. Chúng tôi đã chọn ra 6 loại kháng sinh thường được sử dụng để thử khả năng chịu kháng sinh của 4 chủng vi khuẩn lactic. Sau 48h nuôi cấy, chúng tôi thu được kết quả ở Bảng 3.4 và Hình 3.9.
Bảng 3.4: Khả năng kháng kháng sinh của 4 chủng vi khuẩn STT Kháng sinh Nồng độ trên khoanh giấy VTCC- B-421 VTCC- B-431 VTCC- B-426 VTCC- B-1450 1 Streptomycin 10(μg) R R S S 2 Polymycin B 300IU S R S S 3 Gentamycin 10(μg) S R R S 4 Amoxicillin 20(μg) R I R R 5 Penicillin 10IU R R S R 6 Chloramphenicol 30(μg) I I R S
Chú thích: R (Resistant): kháng ; I (Intermediate): Trung bình; S (Susceptible) nhạy cảm;
A B
Kí hiệu: 1-Streptomycin, 2-Polymycin B, 3- Gentamycin,
4-Amoxicillin, 5-Penicillin, 6-Chloramphenicol
Hình 3.9: Khả năng chịu kháng sinh của chủng VTCC-B-421(A)
Vi khuẩn lactic khi được đưa vào cơ thể có thể từ các nguồn thức ăn khác nhau hay từ nguồn dược phẩm bổ sung vào cơ thể. Tuy nhiên việc đưa thuốc kháng sinh vào cơ thể qua đường thức ăn để ngăn chặn bệnh tật sẽ ảnh hưởng đến các chủng vi khuẩn lactic trong cơ thể. Từ kết quả này có thể thấy khả năng chịu kháng sinh của các chủng nghiên cứu rất khác nhau. Chủng VTCC-B-431có khả năng kháng mạnh nhất: 4/6 loại kháng sinh. Chủng VTCC-B-421 và VTCC-B-426 kháng được 3/6 loại kháng sinh. Chủng VTCC-B-1450 chịu kháng sinh kém nhất, chỉ chịu được 2/6 loại kháng sinh.
3.3.6. Kết quả kiểm tra khả năng ức chế một số chủng vi sinh vật gây bệnh
Khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh là một trong các chỉ tiêu quan trọng trong đánh giá khả năng probiotic. Vai trò chính của probiotic là ngăn cản sự thâm nhập và phát triển vi sinh vật gây bệnh. Kết quả đánh giá khả năng ức chế một số chủng vi sinh vật gây bệnh của 4 chủng vi khuẩn được trình bày ở Bảng 3.5 và Hình 3.10.
Bảng 3.5: Khả năng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh của 4 chủng vi khuẩn
Hoạt tính ức chế một số vi sinh vật gây bệnh được đánh giá là có vòng kháng khuẩn càng rộng thì khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh càng tốt. Kết
STT Kí hiệu chủng Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) E.coli Salmonella enterica Staphylococcus aureus Bacillus cereus 1 VTCC-B-421 11 9 5 8 2 VTCC-B-431 10 12 6 2 3 VTCC-B-426 10 12 7 8 4 VTCC-B-1450 9 10 4 4
kiểm định.Trong đó 2 chủng VTCC-B-421 và VTCC-B-426 có hoạt tính ức chế cao hơn.
A B
Kí hiệu:1:VTCC-B-421;2:VTCC-B-431;3:VTCC-B-426;4:VTCC-B-1450
Hình 3.10: Khả năng ức chế Bacillus cereus(A) và Salmonella enterica(B)
của 4 chủng vi khuẩn
3.3.7. Khả năng sinh acid lactic của 4 chủng vi khuẩn
Sau khi tiến hành nuôi cấy các chủng nghiên cứu trên môi trường MRS ở nhiệt độ 37oC trong 48h, chúng tôi tiến hành xác định khả năng sinh acid lactic của các chủng. Kết quả được thể hiện trong Bảng 3.6.
Bảng 3.6: Khả năng sinh acid lactic của 4 chủng vi khuẩn
STT Kí hiệu chủng Hàm lượng acid lactic (mg/ml) 1 VTCC-B-421 21 2 VTCC-B-426 20 3 VTCC-B-431 22 4 VTCC-B-1450 18
Kết quả thu được cho thấy hàm lượng acid lactic do các chủng sinh ra tương đối đồng đều từ 18-22mg/ml. So sánh với kết quả nghiên cứu của tác giả Đào Thị Lương và cộng sự (2010)[5], chúng tôi thấy rằng 4 chủng nghiên cứu đều có khả năng sinh acid lactic cao, đáp ứng tiêu chí lựa chọn chủng có hoạt tính probiotic.
Với mục đích sử dụng 4 chủng vi khuẩn lactic: VTCC-B-421; VTCC- B-431; VTCC-B-426; VTCC-B-1450 có khả năng sinh GABA làm probiotic, chúng tôi đã tiến hành khảo sát một số đặc điểm quan trọng cần cho prbiotic. Các nghiên cứu lựa chọn chủng vi khuẩn lactic làm probiotic thường quan tâm đến các chỉ tiêu quan trọng như: chủng an toàn, khả năng sống và phát triển trong đường tiêu hóa của vật chủ: dịch dạ dày, ruột non, chịu được muối mật, pH thấp, khả năng bám dính và sinh bacteriocin. Kết quả nghiên cứu của chủng tôi cho thấy cả 4 chủng lựa chọn sinh GABA đều là các chủng an toàn (GRAS) có khả năng tồn tại trong đường tiêu hóa của vật chủ cụ thể đảm bảo tỷ lệ sống cao > 107 CFU/ml trong dịch dạ dày và dịch ruột (Bảng 3.2), chịu được pH 2-3 (Hình 3.7), chịu được nồng độ muối mật 0,3% (Hình 3.8). Đây là yêu cầu tiên quyết đối với các chủng dùng cho sản xuất probiotic để đảm bảo an toàn và tồn tại, phát triển trong hệ tiêu hóa của vật chủ. Các nghiên cứu trước đây [8],[12], đều tiến hành khảo sát khả năng chịu muối mật của chủng Lactobacillus nghiên cứu trong giới hạn 0,05-1%. Các chủng được nghiên cứu, có khả năng tồn tại, phát triển trong hệ tiêu hóa vật chủ, không chỉ sinh acid lactic và acid hữu cơ khác (acid acetic, propionic) có vai trò giảm pH trong hệ tiêu hóa mà còn sinh các bacteriocin có khả năng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh như Salmolella, E.coli, Clostridium. Để đánh giá khả năng tồn tại trong đường tiêu hóa, khả năng tồn tại trong môi trường với các loại kháng sinh khác nhau của 4 chủng cũng được chúng tôi khảo sát (Bảng 3.4). Với chỉ tiêu này, các nghiên cứu khác cũng khác nhau về số lượng và loại kháng sinh sử dụng: nghiên cứu của P.B.Chauhan [12] sử
Penicillin (15µg) và Vancomycin (30 µg). Trong khi đó nghiên cứu của P.K. Jena [27] sử dụng các loại kháng sinh: Chloramphenicol, Quinupristin/Dalfopristin, Clindamycin, Erythromycin, Vancomycin, Ampicillin, Streptomycin, Kanamycin Gentamicin. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng 6 loại kháng sinh (Bảng 3.4) tương đối phổ biến sử dụng trong điều trị rối loạn tiêu hóa trên người. Khả năng bám dính của chủng vi khuẩn lactic có vai trò quan trọng đối với vật chủ ở chỗ: các tế bào vi khuẩn không chỉ đơn thuần là cạnh tranh vị trí bám trên nhu mô ruột, ngăn cản sự tiếp xúc với vi khuẩn và tác nhân gây bệnh (như độc tố) với nhu mô ruột, mà còn có vai trò kích thích hệ miễn dịch của vật chủ. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, 4 chủng vi khuẩn Lactobacillus sinh GABA: VTCC-B- 421; VTCC-B-431; VTCC-B-426; VTCC-B-1450 cơ bản đáp ứng được các yêu cầu chủ yếu cho sản xuất probiotic về tính an toàn, khả năng tồn tại trong đường tiêu hóa vật chủ, khả năng sinh bacterioncin. Việc nghiên cứu sử dụng các chủng này cần có các nghiên cứu thêm liên quan đến khả năng thích hợp cho phát triển công nghệ lên men, thu hồi và phát triển sản phẩm thương mại.
3.4. Kết quả nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp cho quá trình tạo GABA và sinh khối cao của các chủng vi khuẩn lựa chọn GABA và sinh khối cao của các chủng vi khuẩn lựa chọn
3.4.1. Kết quả lựa chọn môi trường
Lượng GABA tích lũy trong môi trường lên men không chỉ phụ thuộc vào chủng vi sinh vật lên men cụ thể mà còn phụ thuộc vào điều kiện lên men như: thành phần môi trường, nhiệt độ, pH, nguồn cacbon, nguồn nitơ, mức độ cung cấp oxy trong quá trình lên men.
Từ các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh GABA, chúng tôi chọn ra 4 chủng VTCC-B-421, VTCC-B-431, VTCC-B-426 và VTCC-B-1450 và tiếp tục đánh giá khả năng sinh GABA và khả năng sinh trưởng của các chủng trong 4 loại môi trường khác nhau. 4 môi trường được lựa chọn bao gồm: môi trường MRS (môi trường thường được sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn lactic,
nhưng giá thành tương đối cao); môi trường cà chua và môi trường cám gạo là hai môi trường với nguồn nguyên liệu dễ có, rẻ tiền; môi trường 18.