Sử dụng Aptamer có nhiều ưu điểm hơn so với sử dụng các kháng thể (http://www.aptagen.com/home.aspx)(Bảng 1.1). Thứ nhất, độ tinh khiết của Aptamer cao hơn được tổng hợp và tinh sạch trong khi đó sản xuất kháng thể phải sử dụng các hệ thống sinh học, các cơ thể sống và quá trình tinh sạch khó khăn hơn. Trong một số trường hợp sử dụng Aptamer sẽ tránh được quá trình nhận biết nhầm các protein đích có cấu trúc tương tư như protein nội sinh hoặc các hợp chất độc hại dẫn đến gây sốc hoặc chết đối tượng xử lý. Thứ hai, giá thành sản xuất Aptamer thấp hơn, thời gian sàng lọc ngắn hơn so với việc sản xuất các kháng thể. Thứ ba, phổ phân tử đích của Aptamer rất rộng so với kháng thể từ những phân tử nhỏ như ion kim loại Na+, Zn2+… đến những đại phân tử, thậm chí tế bào (Liu và cộng sự, 2009; Long và cộng sự, 2009). Thứ tư, Aptamer nhân tạo ổn định hơn trong hầu hết các điều kiện môi trường so với kháng thể. Thứ năm, Aptamer có hạn sử dụng dài hơn và có thể biến tính thuận nghịch mà không mất đặc tính so với kháng thể. Thứ sáu, Aptamer có khả năng liên kết với các phân tử không có tính miễn dịch hoặc các cơ chất có tính độc hại, độc tố. Thứ bảy,
Aptamer có thể dễ dàng thay đổi với thuốc nhuộm, nhãn đánh dấu và các nhómbề mặt mà không ảnh hưởng ái lực của chúng. Cuối cùng, Aptamer có khả năng cải biến hóa học linh hoạt để ứng dụng vào nhiều chức năng, mục đích sử dụng khác nhau.
Bảng 1.1. So sánh ưu điểm của Aptamer và kháng thể
1.3.5. Phương pháp thu nhận Aptamer – Phương pháp SELEX (Systematic
Evolution of Ligands by EXponential enrichment)
Phương pháp SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential
Enrichment) là phương sử dụng một nhóm các kỹ thuật sinh học phân tử để tổng hợp in vitro oligonucleotide (có thể là ssADN, dsADN, ARN, các đoạn peptide) có khả năng
Đặc điểm so sánh Aptamer Kháng thể Tổng hợp hóa học Có Không
Chất lượng Cao hơn Thấp hơn Giá thành sản xuất Thấp hơn Cao hơn Thời gian sử dụng Dài hơn Ngắn hơn Mức độ ổn định trong các điều
kiện môi trường Cao hơn Thấp hơn Nhận biết phân tử đích là các
chất, phân tử độc, không có hoạt tính miễn dịch
Có Không
Khả năng biến tính thuận
nghịch Cao hơn Thấp hơn
Thay đổi chất đánh dấu, nhóm bề mặt
Dễ dàng mà không ảnh hưởng hoạt tính của Aptamer
Khó, dễ ảnh hưởng hoạt tính sinh học của kháng thể
liên kết với phối tử, mục tiêu phối tử (phân tử đích) (Ellington & Szostak,1992). Trong quá trình sàng lọc Aptamer theo một quy trình SELEX gồm nhiều vòng sàng lọc với 3
quá trình: chọn lọc những trình tự oligonucleotide (Aptamer) gắn với phân tử đích từ
thư viện oligonucletide ngẫu nhiên, thu nhận và khuếch đại những Aptamer có khả năng liên kết đặc hiệu với phân tử đích (Ellington & Szostak, 1992; Tuerk & Gold, 1990).
Hình 1.6: Quy trình Phương pháp Systematic Evolution of Ligands by Exponential
Enrichment (SELEX).
Quy trình SELEX sàng lọc Aptamer bắt đầu từ một thư viện oligonucleotide ADN (Ellington & Szostak,1992; Tuerk & Gold, 1990) ngẫu nhiên.
5’ 3’
Vùng cố định Vùng ngẫu nhiên Vùng cố định
Thư viện này gồm ssADN có độ đa dạng cao (khoảng 1015 phân tử). Mỗi ssADN có một vùng trung tâm là các trình tự ngẫu nhiên có n nucleotide từ 20 - 80 nucleotide được gắn với hai đầu là những trình tự cố định (vùng cố định này là vị trí gắn mồi cho phản ứng PCR) khoảng 18 – 21 nucleotide. Kích thước của vùng ngẫu nhiên gồm n nucleotide quyết định sự phức tạp của thư viện, có thể tính đơn giản là 4n phân tử. Ví dụ, khi lựa chọn vùng ngẫu nhiên gồm 40 nucleotide sẽ tạo ra 440 phân tử khác nhau. Việc lựa chọn số lượng nucleotide thích hợp trong vùng ngẫu nhiên giúp tăng khả năng sàng lọc được những phân tử Aptamer có ái lực cao, bền vững với phân tử đích. Trong các thí nghiệm đã được tiến hành về Aptamer, sử dụng phương pháp SELEX chọn lọc trong thư viện ban đầu có 109 đến 1014, 1015 phân tử đồng nghĩa với việc lựa chọn vùng ngẫu nhiên có số nucleotide từ 20 – 80 (David & Szostak , 2002).
Để tăng tính phức tạp của thư viện oligonucleotide, ta có thể sử dụng thư viện oligonucleotide được cải biến hóa học, cung cấp những khả năng mới cho sự tương tác với những phân tử đích như tăng cường sự bền vững của cấu hình oligonucleotide. Cải biến được sử dụng khá phổ biến ở đây là thay thế nhóm 2’ – OH của nucleotide prymidine thành nhóm 2’ – NH2. Sự cải biến này giúp bảo vệ các ARN không bị thoái
hóa do các enzyme nuclease phân hủy. Hàng loạt các dUTP mang axit amin được cải
biến ở vị trí cacbon số 5 sẽ giúp tăng cường quá trình cải biến của ADN. Những cải biến này đã được ứng dụng cho quá trình chọn lọc Aptamer như sử dụng cho các thí
nghiệm chọn lọc in vitro sàng lọc Aptamer gắn với phân tử đích dạng anion (Baugh và
cộng sự, 2000).
Quá trình sàng lọc, thư viện được ủ với những phân tử đích trong đệm, nhiệt độ phù hợp. Sau đó, sử dụng các kỹ thuật khác nhau để tách các phức hợp Aptamer – đích ra khỏi những phân tử không gắn đặc hiệu. Sử dụng màng nitrocellulose là phương pháp phổ biến để tách những phân tử protein. Ngoài ra, một số phương pháp như cố định các phân tử đích vào một phức hệ đặc biệt như sepharose, agarose hay hạt từ tính
cũng là những phương pháp được sử dụng cho giai đoạn tách. Những trình tự gắn đặc hiệu đã thu được sau giai đoạn phân tách được giải hấp và khuếch đại để cung cấp thư viện cho vòng sàng lọc sau (Dieckmann và cộng sự, 1995). Quá trình chọn lọc và khuếch đại này được lặp lại cho đến khi sàng lọc được Aptamer có ái lực cao nhất với phân tử đích. Phân tử Aptamer được lựa chọn sẽ được chuyển sang quá trình tách dòng và giải trình tự (David & Szostak, 2002; Ellington & Szostak,1992; Tuerk & Gold, 1990).
Aptamer đã được chứng minh như yếu tố nhận biết sinh học thích hợp và hiệu quả phân tử đích trong các Biosensor. Biosensor là thiết bị phân tích để xác định các phân tử đích, là thiết bị có sự kết hợp thành phần sinh học với thành phần xác định hóa lý. Khi ứng dụng Aptamer như một yếu tố nhận biết sinh học thì Biosensor còn được
gọi là Aptasensor.
Tín hiệu nhận được từ các tương tác giữa chất phân tích với yếu tố sinh học (Aptamer) được chuyển đổi thành tín hiệu khác để có thể dễ dàng định tính và định lượng. Việc phát triển các Aptasensor được được nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới tiến hành với nhiều cải biến khác nhau, nhưng về cơ bản có phân thành hai hệ cơ bản đó là hệ sử dụng Aptamer tự do và hệ sử dụng Aptamer cố định.
Aptasensor cũng có thể phân thành hai dạng chính: Aptasensor quang và Aptasensor điện hóa: (1) Aptasensor quang liên quan tới việc sử dụng các Aptamer
đánh dấu huỳnh quang (fluorescence), luminophore, enzyme, các hạt nano hoặc các
Aptamer với hệ xác định không đánh dấu (chẳng hạn cộng hưởng bề mặt (Sassolas et al., 2011). Ví dụ, ARN Aptamer được sàng lọc và sử dụng để tạo Aptasensor xác định
yếu tố phát triển nội mạch biểu mô (vesicular endothelial growth factor, VEGF)
(Drolet et al., 1996). (2) Aptasensors điện hóa, phụ thuộc vào việc cố định Aptamer lên bề mặt điện cực. Khi đó điều kiện gắn kết của Aptamer với phân tử đích của nó được biểu thị bằng sự thay đổi dòng điện hóa (Willner ADN Zayats, 2007). Ví dụ,
Aptasensor điện hóa được chế tạo dựa trên 2 Aptamer nhận biết các epitope khác nhau của thrombin đã được thiết kế và ứng dụng. Aptamer thứ nhất được thiol hóa và cố định lên điện cực vàng để tóm bắt thrombin trong khi đó Aptamer thứ hai được đánh dấu với pyrroloquinoline quinone glucose dehydrogenase (Ikebukuro et al., 2005). Một số Aptasensor cũng đã được phát triển để các định các protein của vi khuẩn và virus, ví dụ ARN Aptamer chip đã được chế tạo thành công để xác định kháng nguyên lõi của vi khuẩn viêm gan C (Lee et al., 2007) hoặc Aptasensor xác định HIV-1 Tat (Tombelli et al., 2005).
CHƯƠNG II
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2. 1. VẬT LIỆU
2.1.1. Sinh phẩm
- Thư viện ADN sợi đơn với 1015 phân tử có trình tự 5’ – ATC CGT CAC ACC TGC TCT CAT ATG – N40 – ATA CGG GAG CCA ACA CCA AAG CTTC – 3’ nhận từ phòng Công nghệ Tế bào Động vật.
- Vector tách dòng pCR2.1-TOPO (Invitrogen) và dòng tế bào vi khuẩn E.coli
chủng DH5α phục vụ cho việc tách dòng đoạn gen đích. - Cặp mồi dùng để nhân bản đoạn gen:
ApF2: 5’ – ATC CGT CAC ACC TGC TCT CAT ATG – 3’ Tm = 65,30C ApR2: 5’ – ATA CGG GAG CCA ACA CCA AAG CTTC – 3’ Tm = 67,40C
- Mồi cải biến:
ApR2Ph: 5’ – Phosphoryl – ATA CGG GAG CCA ACA CCA AAG CTTC – 3’ 2.1.2. Hóa chất
- Phức hợp protein HER2 – Niken Resin, hạt nano vàng do phòng CNTBĐV cung cấp.
- Màng PVDF – Polyvilidene Fluoride (PALL, Mexico), BSA – Bovine Serum Albumin (Sigma), sữa, methanol, Tween 20%, …
- Cao nấm men (Yeast extract), Tryptone, Agar, các chất kháng sinh Kanamycin
và Ampicilin, Chloroform, Isoamylalcohol, Agarose, SDS, Etbt, nước khử ion 2 lần, nước đã xử lý ARN và ADN,…
- Bộ Kit tinh sạch ADN từ gel agarose (QIAgen), Kit tách dòng TOPO – TA của
hãng Invitrogen. Enzyme lamda exonucleaza, đệm, MgCl2, Taq Polymeraza (Promega,
* Môi trường nuôi cấy
- Môi trường LB lỏng: Cao nấm men 0,5%; Tryptone 1%; NaCl 0,5% - Môi trường LB đặc: Môi trường LB lỏng có bổ sung 1.5% agar.
- Môi trường LB đặc + Kanamycin: Môi trường LB đặc bổ sung 50μg/ml Kanamycin
Các môi trường trên được khử trùng ở 1210C, 1atm trong 30 phút, kháng sinh được bổ sung sau khi nhiệt độ giảm đên khoảng 500C.
* Các dung dịch
- Dung dịch I: Tris – HCl 50 mM, pH = 8,0; EDTA 10 mM, pH = 8,0; Glucose 50mM
- Dung dịch II: NaOH 0,2 M; SDS 1%
- Dung dịch III: Kali acetate 3 M; Axit acetic băng 11,5% - TE: Tris – HCl 1 M, pH = 8,0; EDTA 0,5 M, pH = 8,0 - Dung dịch Chloroform/Isoamylalcohol: 24:1
- TAE: Tris – base; Axit acetic băng; EDTA, pH 8, nước cất
- PBS 10X: Na2HPO4 80,6 mM, KH2PO4 19,4 mM, KCL 27mM, NaCl 1,37 M, pH 7,4, nước khử ion
- Gel agarose 0,8% pha trong TAE 1 lần
- 3-Mercaptopropionic acid (MPA), 2-(N-morpholino) ethane-sulfonic acid (MES), N-hydroxy-succinimide (NHS), 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC), K3Fe(CN)6, K4Fe(CN)6, BSA (Bovine Serum Albumin), PBS (Phosphate Buffered Saline), potassium hydroxide (KOH), hydrogen peroxide (H2O2) (Sigma–Aldrich), Các dung dịch: 3-Mercaptopropyl trimethoxysilane, NaOH 0,01 N, dung dịch H2O2 đậm đặc, dung dịch H2SO4 đậm đặc, sodium borohydride (NaBH4), dH2O siêu sạch (Invitrogen); dung dịch nhuộm protein coomassie blue, dung dịch tẩy màu, cồn tuyệt đối và các hóa chất cần thiết khác đều là những hóa chất tinh khiết do các Hãng có uy tín cung cấp.
2.1.3. Trang thiết bị - Lò vi sóng - Lò vi sóng - Tủ cấy vô trùng - Máy ly tâm - Tủ lạnh sâu (-200C, -850C) - Máy đo pH - Máy Vortex - Máy soi gel
- Máy hút chân không - Cân phân tích - Máy PCR
- Máy lắc ổn nhiệt 370C - Bể ổn nhiệt
- Pipetman, đầu côn các loại - Cân điện tử
- Máy điện di - Máy Nano Drop
- Các thiết bị khác của phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen. 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Sàng lọc Aptamer đặc hiệu HER2 (Phương pháp SELEX)
2.2.1.1. Chuẩn bị thư viện
* PCR làm giàu thư viện:
Một thư viện ADN sợi đơn có trình tự 5’ – ATC CGT CAC ACC TGC TCT CAT ATG – N40 – ATA CGG GAG CCA ACA CCA AAG CTTC – 3’ nhận từ phòng Công nghệ Tế bào Động vật được sử dụng làm nguyên liệu khởi đầu cho sàng lọc. Tuy
nhiên, lượng phân tử đưa vào cho sàng lọc phải đủ lớn nên thư viện cần được PCR làm giàu.
Cặp mồi đã cải biến sau đây được gắn vào đầu 5’ và 3’ của thư viện để sử dụng cho quá trình khuếch đại: mồi ApF2: 5’ – ATC CGT CAC ACC TGC TCT CAT ATG – 3’ và mồi ApR2Ph: 5’ – Phosphoryl – ATA CGG GAG CCA ACA CCA AAG CTTC – 3’.
Phản ứng PCR được thực hiện với thành phần và chu kỳ như sau:
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR làm giàu thư viện
Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích (μL) Dung dịch đệm 10X 2,5
dNTPs 10 nM 2,5
MgCl2 25 mM 1,25 Mồi xuôi 10 pmol/μL 1 Mồi ngược 10 pmol/μL 1 ADN khuôn 10 – 100 ng/μL 2
Taq-polymeraza 5 unit/μL 0,3
H2O 14,45
Tổng thể tích 25
Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR làm giàu thư viện
Nhiệt độ (0C) 94 94 55 72 72 8
Thời gian 3 phút 45 giây 45 giây 45 giây 8 phút ∞
Sau quá trình khuếch đại, chúng ta thu được một lượng lớn các oligonucleotide 20 chu kỳ
gian để ràng buộc kháng nguyên HER2. Do đó, trước mỗi vòng sàng lọc, sản phẩm
PCR cần được xử lý để tạo sợi đơn ADN. Enzyme lamda exonucleaza là một công cụ
hữu hiệu được sử dụng cho quá trình này. * Cắt ADN sợi đôi thành sợi đơn: Trộn hỗn hợp phản ứng cụ thể như sau:
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng tạo sợi đơn ADN Thành phần Thể tích (μL) Sản phẩm PCR 20 Dung dịch đệm 4 Enzyme 2 H2O 14 Tổng thể tích 40
Sau khi trộn đều các thành phần trên, hỗn hợp được ủ 4 tiếng ở bể ổn nhiệt 370C. Cuối cùng, sợi đơn ADN sẽ được tủa để thu lại. Cách thực hiện như sau:
- 0, 475 μL EDTA 0,5 M và 150 μL ethanol 100% được thêm vào mỗi ống mẫu, giữ ở -200C trong 2,5 h.
- Ly tâm 12000 v/p, 20 phút. Loại dịch nổi, thu cặn. - Bổ sung 30 μL H2O vào mỗi mẫu.
Sau khi thu được sản phẩm sợi đơn oligonucleotide, chúng được xử lý biến tính ở 950C trong 5 phút sau đó ngay lập tức đưa xuống 40C, 15 phút rồi ủ ở 250C trong 7 phút để cuộn gấp cấu trúc thứ cấp đặc thù.
2.2.1.2. Sàng lọc
Quy trình của một vòng sàng lọc như sau:
- Phức hợp protein HER2 – Niken được đưa lên cột.
- Ly tâm 3000 vòng/phút trong 4 phút. Loại dịch. - Bổ sung 250 uL dịch rửa (đêm SB + 0.1% Tween 20)
- Lặp lại bước rửa 3 lần.
- Bổ sung 250 uL đệm giải hấp DMSO.
- Hút dịch, giữ lại làm khuôn cho phản ứng PCR, lặp lại bước chuẩn bị thư viện để tiếp tục vòng sàng lọc sau.
Để theo dõi quá trình làm giàu của các phân tử gắn đặc hiệu với HER2 trong suốt quá trình sàng lọc, thư viện đưa vào và sản phẩm thu được sau giải hấp của mỗi vòng được đo nồng độ trên máy Nano Drop. Tuy nhiên, để hạn chế sự làm giàu của những phân tử thu được sau giải hấp nhưng không đặc hiệu HER2, chúng tôi tiến hành sàng lọc vòng loại trừ.
Hỗn hợp trình tự gắn sau vòng sàng lọc cuối cùng được sử dụng để tách dòng và giải trình tự.
2.2.1.3. Phương pháp tách d
Hình 2.1. Quy trình tách dòng và gi
2.2.1.3.1. Nhân bản Aptamer
Mục đích:
Thu nhận một lượng l được nhân lên nhờ chuỗ cho quá trình tách dòng.
Nguyên tắc
PCR (Polymeraza Chain Reaction
khuếch đại một đoạn ADN đ sợi đôi của đoạn ADN đích v
Biến nạp plasmid
Tách chi
Phương pháp tách dòng và giải trình tự.
Quy trình tách dòng và giải trình tự của những oligonucleotide HER2
Aptamer đặc hiệu với HER2 bằng phương pháp PCR
ng lớn các trình tự ADN gắn đặc hiệu với
ỗi phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu, làm nguyên li
Polymeraza Chain Reaction) là phương pháp in vitro
n ADN đặc thù nhờ công hiệu của 2 mồi oligonucleotide n ADN đích với sự tham gia của ADN Polymeraza.
Nhân bản aptamer đặc hiệu HER2
Phân tích điện di trên gel Agarose
Tinh sạch sản phẩm PCR
Gắn gen vào vector pCR2.1 - TOPO
p plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn E.coli chủng DH
ch chiết plasmid tái tổ hợp từ vi khuẩn E.coli
Xác định trình tự nucleotide nucleotide gắn đặc hiệu ương pháp PCR i HER2, sản phẩm u, làm nguyên liệu in vitro để tổng hợp và nucleotide gắn vào 2