Định lượng HER2 trong các mẫu phân tích được tiến hành như sau: Pha kháng nguyên HER2 (kháng nguyên HER2 được tách và tinh sạch từ protein màng của các tế bào BT474 là tế bào ung thư vú biểu hiện mạnh HER2) với các nồng độ 0,35 ng/mL; 3,5 ng/mL và 35 ng/mL. Kết quả xác định dòng và thế bằng kỹ thuật quét thế vòng và sóng vuông đối với các mẫu có nồng độ kháng nguyên HER2 đã biết trước (nhằm mục đích xây dựng đường chuẩn) được trình bày ở hình 3.16 và bảng 3.9.
Bảng 3.9. Kết quả xác định thế và dòng của điện cực ủ với dung dịch HER2
Potential (V) Current (µA) Au Au- MPA- Apt-BSA Au-MPA-Apt- BSA ủ với 0,35 ng/ml HER2 Au-MPA-Apt- BSA ủ với 3,5 ng/ml HER2 Au-MPA-Apt- BSA ủ với 35 ng/ml HER2 0 0,767 0,936 0,449 0,48 0,307 0,05 1,15 1,05 0,524 0,628 0,355 0,1 2,54 1,35 0,733 0,774 0,505 0,15 11 2,1 1,41 1,39 0,877 0,20 15,5 3,01 2,12 1,92 1,29 0,25 9,39 3,24 2,65 2,28 1,65 0,30 2,2 3,22 2,89 2,61 1,98 0,35 1,46 3,06 2,86 2,71 2,29
0,40 2,05 2,62 2,59 2,67 2,12 0,45 1,7 2,1 2,27 2,39 1,69 0,50 1,48 1,66 1,81 2,07 1,76 0,55 1,38 1,34 1,36 1,44 1,59 0,60 1,43 1,12 1,1 1,21 1,24
Kết quả xác định đường hồi quy tuyến tính biểu diễn mối tương quan giữa độ lớn của dòng oxy hóa và nồng độ kháng nguyên HER2 là y = 2,9514 -0,0285x với hệ số tương quan r = -0,91587. Hệ số tương quan cho thấy hai đại lượng này có tương quan mạnh trong khoảng nồng độ HER2 từ 0 đến 50 ng/mL và tương quan của hai biến này là tương quan nghịch. Ngưỡng xác định của Biosensor là 5 ng/ml.
Hình 3.16. Thế vòng (CV) và sóng vuông (SWV) cuả điện cực Au và Au-MPA-Apt- BSA ủ với các nồng độ kháng nguyên HER2 khác nhau: (1).Điện cực Au; (2). Điện cực Au-MPA-Apt-BSA ủ với dung dịch 0,35ng/ml HER2; (3). Điện cực Au-MPA-apt- BSA ủ với dung dịch 3,5 ng/ml HER2; (4, 5). Điện cực Au-MPA–apt-BSA ủ với 35 ng/ml HER2.
Như vậy: Biosensor điện hóa sử dụng Aptamer đặc hiệu HER2 trong ung thư vú gắn cộng hóa trị lên bề mặt điện cực thông qua lớp polymer mỏng đã được chế tạo thành công. Ngưỡng xác định của Biosensor với kháng nguyên HER2 là 5 ng/ml.
1
5
1
THẢO LUẬN
Liu và cộng sự (2012) sử dụng peptide NCTHSCVDLDDKGCPAEQR, là một đoạn ngoại bào của kháng nguyên HER2 làm đích sàng lọc Aptamer. Các tác giả đã thu được Aptamer có khả năng gắn kết với HER2 gồm 86 nucleotide: 5’-AACCGCCCAA ATCCCTAAGA GTCTGCACTT GTCATTTTGT ATATGTATTT GGTTTTTGGC TCTCACAGAC ACACTACACA CGCACA-3’. Cấu trúc bậc 2 của Aptamer này khi kiểm tra bằng phần mềm mfold với năng lượng tự do thấp nhất là ΔG = -0.90 kcal/mol. Ái lực liên kết của Aptamer có giá trị Kd = 18,9 nM với peptide đã sử dụng làmg đích sàng lọc và ái lực gắn kết với giá trị Kd = 316 nM tới vùng ngoại bào của HER2.
Trong khi đó, một trong Aptamer mà chúng tôi nhận được với 8 vòng sàng lọc dương tính trên tế bào BT474 và một vòng sàng lọc âm tính trên dòng tế bào MDA- MB-231 gồm 88 nucleotide (bao gồm cả vùng bảo thủ, vùng gắn kết của các primer trong quá trình sàng lọc): 5’-AACCGCCCAA ATCCCTAAGA GTCGCAGCGG TGTGGGGGCA GCGGTGTGGG GGCAGCGGTG TGGGGCACAG ACACACTACA CACGCACA-3’. Khi phân tích cấu trúc bậc 2 bằng phần mềm mfold chúng tôi nhận được cấu trúc đặc trưng của Aptamer này với năng lượng tự do ΔG = - 12.25 kcal/mol.
Theo chúng tôi, vùng ngẫu nhiên (40 nucleotide) là vùng khác nhau giữa các Aptamer trong thư viện ban đầu là thư viện được sử dụng để sàng lọc trên tế bào ung thư vú BT474 biểu hiện mạnh HER2, do vậy các đoạn nucleotide có khả năng nhận biết và gắn kết đặc hiệu với HER2 trên tế bào BT474 phải nằm trong vùng ngẫu nhiên. Do vậy, chúng tôi loại bỏ các nucleotide vùng bảo thủ và khi đó Aptamer bao gồm các nucleotide thuộc vùng nhẫu nhiên sẽ được sử dụng cho các nghiên cứu tạo KIT và tạo phức hệ dẫn thuốc. Aptamer khi đó có trình tự nucleotide như sau: 5’-GCAGCGGTGT GGGGGCAGCG GTGTGGGGGC AGCGGTGTGG GG-3’. Khi phân tích cấu hình không gian bậc 2 của Aptamer này bằng phần mềm mfold chúng tôi nhận được 1 trong
các dạng cấu trúc với năng lượng tự do thấp nhất (ΔG = -5.63 kcal/mol). Ái lực liên kết của Aptamer này được xác định với giá trị Kd = 100 nM.
Shu và cộng sự (2013) đã chế tạo Biosensor xác định kháng nguyên ung thư (Shu, 2013), trong đó phức hệ giữa Aptamer và kháng nguyên carcinoembryonic antigen (CEA) tạo ra được đánh giá thông qua giá trị tổng trở EIS và giá trị đo trong xung vi phân với việc sử dụng cặp chất dò oxy hóa khử [Fe(CN)6]-3/[Fe(CN)6]-4.
Theo nguyên lý điện hóa mà các tác giả khác đã sử dụng để định lượng protein, chúng tôi đã chế tạo Biosensor điện hóa sử dụng hoặc là điện cực dạng ống, hoặc điện
cực dạng chip (screen-printed electrode) để định lượng kháng nguyên HER2. Kết quả
cho thấy Biosensor sử dụng điện cực dạng ống và thiết bị CPA IoP HH5 chúng tôi đã xác định mối tương quan tuyến tính giữa độ lớn của dòng oxy hóa và nồng độ HER2 là y=2,9514 -0,0285x, hệ số tương quan r=-0,91587. Hệ số tương quan cho thấy hai đại lượng này có tương quan mạnh trong khoảng nồng độ HER2 từ 0 đến 50 ng/mL và tương quan là tương quan nghịch. Ngưỡng xác định của Biosensor là 5 ng/mL.
CHƯƠNG IV
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
1. Đã sàng lọc được 2 Aptamer. Cả 2 Aptamer thu nhận được đều có khả năng liên kết đặc hiệu với kháng nguyên HER2 khi kiểm tra bằng Dot Blot, kiểm tra bằng nhận biết trên tế bào BT474 biểu hiện mạnh HER2;
2. Sử dụng Aptamer số 2 đặc hiệu HER2 đã chế tạo Biosensor điện hóa xác định HER2 với ngưỡng xác định của Biosensor là 5 ng/ml.
KIẾN NGHỊ
Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện và thử nghiệm Biosensor điện hóa xác định kháng nguyên HER2 trong các mẫu bệnh phẩm để đánh giá tính khả dụng của Biosensor này trong thực tiễn lâm sàng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Nguyễn Chấn Hùng. (2010). Hội thảo “Những tiến bộ trong điều trị ung thư vú với hóa xạ trị”.
Tiếng Anh
2. Baugh, C., D. Grate, C.Wilson (2000), “2.8 angstrom crystal structure of the
malachite green Aptamer.”, J. Mol. Biol. 301 : 117–128. (9)
3. Ciesiolka J, Gorski J & Yarus M (1995). Selection of an RNA domain that binds Zn2+. RNA, 1, 538–550.
4. David JH & Szostak JW (2002), “Isolation of high – affinity GTP Aptamer from partially structured ARN libraries.”, Proc. Nalt. Acad. Sci. USA. 99, 11616- 11621. (16)
5. Dieckmann T., E. Fujikawa, X. Xhao, J. Szostak, J. Feigon (1995), “Structural Investigations of ARN ADN ADN Aptamers in Solution”, JouARNl of Cellular Biochemistry : 56–56. (18).
6. Dhillon N, Wolff R A, Abbruzzese J L, Hong D S, Camachi L H, and Li L (2006). Phase II clinical trial of curcumin in patients with advanced pancreatic cancer. J. Clin. Oncol. 24 14151
7. Drolet DW, Moon–McDermott L, & Romig TS, (1996). An enzyme–linked oligonucleotide assay. Nat Biotechnol 14:1021–1025.
8. Duconge F & Toulme JJ (1999). In vitro selection identifies key determinants
for loop–loop interactions: RNA Aptamers selective for the TAR RNA element
9. Ellington AD, Szostak JW, (1990): In vitro selection of ARN molecules that bind specific ligands. Nature, 346:818-822.
10.Ellington AD & Szostak JW. (1992), “Selection In vitro of single – strand ADN
molecules that fold into specific ligand – binding structures.”, Nature, 355, 850- 852. (22)
11.Famulok M (1999). Oligonucleotide Aptamers that recognize small molecules.
Curr. Opin. Struct. Biol. 9, 324–329.
12.Farooq, S; Coleman, MP. (2005). Breast cancer survival in South Asian women in England and Wales. JouARNl of epidemiology ADN community health 59 (5). pp. 402-406. ISSN 0143-005X.
13.GEDDES M, FRANCESCHI S, BALZI D, ARNIANI S, GAFA L AND ZANETTI R ON BEHALF OF AIRT. (1995). Birthplace AND classic Kaposi's sarcoma in Italy. J. Natl Cancer Inst., 87, 1015- 1017.
14.Guerrier–Takada C & Altman S (1984). Catalytic activity of an RNA molecule
prepared by transcription in vitro. Science, 223, 285–286.
15.Green LS, Jellinek D, Jenison R, Ostman A, Heldin CH & Janjic N (1996). Inhibitory DNA ligANDs to platelet–derived growth factor B–chain.
Biochemistry, 35, 14413–14424.
16.Hofmann HP, Limmer S, Hornung V, Sprinzl M (1997). Ni2+–binding RNA
motifs with an asymmetric purine–rich internal loop and a G–A base pair. RNA,
3, 1289–1300.
17.Ikebukuro K, Kiyohara C, & Sode K, (2005). Novel electrochemical sensor system for protein using the Aptamers in sandwich manner. Biosens Bioelectron 20:2168–2172.
18.Lee ES, Oh KT, Kim D, Youn YS, Bae YH. (2007). Tumor pH-responsive flower-like micelles of poly(Llactic acid)-b-poly (ethylene glycol)-b-poly(L- histidine). JouARNl of Controlled Release;123(1): 19–26.
19.Lin M, Cho M, Choe WS, Son Y, Lee Y, (2009). Electrochemical detection of copper ion using a modified copolythiophene electrode. Electrochimica Acta 54:7012–7017.
20.Liu M., T.Kagahara, H.Abe, Y.Ito. (2009), “Direct In Vitro Selection of Hemin- Binding ADN Aptamer with Peroxidase Activity”, Bulletin of the Chemical Society of Japan 82 : 99–104. (45)
21.Liu Z, Duan JH, Song YM, Ma J, Wang FD, Lu X, Yang XD, (2012). Novel HER2 Aptamer Selectively Delivers Cytotoxic Drug to HER2-positive Breast Cancer Cells in Vitro. JouARNl of Translational Medicine 10:148 doi:10.1186/1479-5876-10-148
22.Long S., M. Long, R. White, B. Sullenger. (2008), “Crystal structure of an ARN Aptamer bound to thrombin”. ARN 14 (2): 2504–2512. (46)
23.Moelans CB, deWeger RA, VanderWall E, vADNiest PJ, (2011). Current technologies for HER2 testing in breast cancer. Crit.Rev.Oncol. Hematol. 80380–392
24.Pyle AM (1993). Ribozymes: a distinct class of metalloenzymes. Science, 261,
709–714.
25.Sassolas, A, Blum, L. J, Leca, Bouvier B.D. (2011): Immobilization Strategies to Develop Enzymatic Biosensors Biotechnology Advances, 30, 3:489-571 26.Shu H, Wen W, Xiong H, Zhang X, Wang S, (2013). Novel electrochemical
detection of carcinoembryonic antigen. Electrochemistry Communications 37: 15-19.
27.Stoltenburg R, Reinemann C & Strehlitz B. SELEX–A (r)evolutionary method
to generate high–affinity nucleic acid ligands (2007). Biomolecular
Engineering, 24, 381–403.
28.Tan L-D, Xu Y-Y, Yu Y, Li X-Q, Chen Y, et al. (2011) Serum HER2 Level Measured by Dot Blot: A Valid and Inexpensive Assay for Monitoring Breast Cancer Progression. PLoS ONE 6(4): e18764. doi:10.1371/jouARNl.pone.0018764.
29.Tombelli S, Minunni M, & Mascini M, (2005). Analytical applications of Aptamers. Biosens Bioelectron 20:2424–2434.
30.Toulme JJ, Darfeuille F, Kolb GL, Chabas S & Staedel C (2003). Modulating
viral gene expression by Aptamers to RNA structures. Biol. Cell, 95, 229–238.
31.Tuerk C, Gold L, (1990): Systematic evolution of ligands by exponential enrichment — ARN ligands to bacteriophage-T4 ADN-polymerase. Science, 249:505-510.
32.Venter DJ, Tuzi NL, Kumar S, Gullick WJ. (1987). Overexpression of the c- erbB-2 oncoprotein in human breast carcinomas: Immunohistological assessment correlates with gene amplification. Lancet ii: 69-72.
33.Willner I, & Zayats M, (2007). Electronic Aptamer-based sensors. Angew Chem Int Ed Engl 46:6408–6418
34.Witton CJ, Reeves JR, Going JJ et al. (2003). Expression of the HER1–4 family of receptor tyrosine kinases in breast cancer. J. Pathol 200:290–297.
35.Zaug AJ & Cech TR (1986). The intervening sequence RNA of Tetrahymena is
Tài liệu Internet
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
****************
ĐÀO MINH ĐỨC
NGHIÊN CỨU TẠO BIOSENSOR XÁC ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN HER2
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14
LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. LÊ QUANG HUẤN