Mục đích:
Thu nhận một lượng l được nhân lên nhờ chuỗ cho quá trình tách dòng.
Nguyên tắc
PCR (Polymeraza Chain Reaction
khuếch đại một đoạn ADN đ sợi đôi của đoạn ADN đích v
Biến nạp plasmid
Tách chi
Phương pháp tách dòng và giải trình tự.
Quy trình tách dòng và giải trình tự của những oligonucleotide HER2
Aptamer đặc hiệu với HER2 bằng phương pháp PCR
ng lớn các trình tự ADN gắn đặc hiệu với
ỗi phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu, làm nguyên li
Polymeraza Chain Reaction) là phương pháp in vitro
n ADN đặc thù nhờ công hiệu của 2 mồi oligonucleotide n ADN đích với sự tham gia của ADN Polymeraza.
Nhân bản aptamer đặc hiệu HER2
Phân tích điện di trên gel Agarose
Tinh sạch sản phẩm PCR
Gắn gen vào vector pCR2.1 - TOPO
p plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn E.coli chủng DH
ch chiết plasmid tái tổ hợp từ vi khuẩn E.coli
Xác định trình tự nucleotide nucleotide gắn đặc hiệu ương pháp PCR i HER2, sản phẩm u, làm nguyên liệu in vitro để tổng hợp và nucleotide gắn vào 2 ng DH5α E.coli
Kỹ thuật tổng hợp ADN ngoài cơ thể cũng cần tuân thủ những nguyên tắc cơ bản của sao chép ADN trong cơ thể như: đoạn ADN cần nhân bản phải mở xoắn thành 2 mạch đơn, cần có các cặp mồi (mồi xuôi, mồi ngược), cần nguyên liệu, điều kiện môi
trường thích hợp và enzyme ADN Polymeraza. Tuy nhiên kỹ thuật PCR có khác là
dùng nhiệt độ cao (940C) tháo xoắn thay cho enzyme helicase kết hợp với enzyme
ADN Polymeraza chịu nhiệt và hệ thống nhiệt cho từng giai đoạn phản ứng tổng hợp
cùng với các đoạn mồi được thiết kế chủ động. Nhờ kỹ thuật PCR mà với một lượng nhỏ ADN ban đầu chúng ta có thể thu được đủ lượng ADN cần thiết kế để tiến hành các thí nghiệm về ADN.
Một phản ứng PCR là một chuỗi phản ứng gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn: giai đoạn biến tính, giai đoạn bắt cặp và giai đoạn kéo dài chuỗi.
Cách tiến hành phản ứng PCR
Phản ứng PCR khuếch đại các trình tự gắn sử dụng cặp mồi ApF2/ApR2, thành phần và chu kỳ phản ứng nhau sau:
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại các trình tự gắn Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích (μL) Dung dịch đệm 10X 2,5
dNTPs 10 nM 2,5
MgCl2 25 mM 1,25 Mồi xuôi 10 pmol/μL 1 Mồi ngược 10 pmol/μL 1 ADN khuôn 10 – 100 ng/μL 5
Taq-polymeraza 5 unit/μL 0,3
H2O 11,45
Bảng 2.5. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại các trình tự gắn Nhiệt độ (0C) 94 94 55 72 72 8
Thời gian 3 phút 45 giây 45 giây 45 giây 8 phút ∞