Thông thường sau khi chạy PCR, trong trường hợp tốt nhất là chỉ có 1 sản phẩm duy nhất (đặc hiệu) thì mẫu vẫn còn bị lẫn tạp với 1 lượng mồi, dNTPs dư và enzyme
ADN Polymeraza. Những chất lẫn tạp này có khả năng ảnh hưởng đến phản ứng giải
trình tự Sanger (sử dụng ddNTP). Để loại bỏ chất lẫn tạp, ta cần thêm bước tinh sạch sản phẩm.
Sản phẩm sau phản ứng PCR được tiến hành tinh sạch theo kit của hãng Qiagen như sau:
Bước 1: Thêm 5 lần thể tích buffer 1 vào sản phẩm PCR, trộn đều.
Bước 2: Chuyển dịch vào cột gắn ADN và ly tâm 12000 vòng/phút, 1 phút. Bước 3: Loại dịch phía dưới cột gắn.
Bước 4: Thêm 500μL buffer 2 vào cột và ly tâm 12000 vòng/phút, 1 phút. Bước 5: Loại dịch phía dưới cột.
Bước 6: Lặp lại bước 4 và bước 5.
Bước 7: Làm khô bằng cách ly tâm tiếp một lần nữa ở 12000 vòng/phút, 1 phút. Bước 8: Thêm 30μL nước vào cột ly tâm 12000 vòng/phút, 1 phút.
Bước 9: Chuyển dịch sau ly tâm sang ống eppendorf mới và bảo quản sản phẩm sau tinh sạch để tiến hành giải trình tự.
2.2.1.3.4. Phản ứng gắn gen v
Nguyên tắc:
Quá trình tách dòng
PCR vào vector tách dòng pCR2.1 với mục đích tạo vector tái t
ứng dựa trên việc tạo ra m mà không phụ thuộc vào trình t
thiết kế trên vector tách dòng pCR2.1. vào vector dễ dàng hơn khi có m
Hình 2.2. Sơ đ Cách tiến hành: Tách dòng sử dụng b thành phần của phản ứng r Bảng 2.7. Thành ph Tên hóa ch Sản ph
ản ứng gắn gen vào vector tách dòng
Quá trình tách dòng được thực hiện bằng cách gắn trực tiếp sả PCR vào vector tách dòng pCR2.1-TOPO (Invitrogen). Phản ứng g
o vector tái tổ hợp mang đoạn ADN mong muốn. Nguyên t o ra một gốc Adenin tự do đầu 3' trên sản phẩm c c vào trình tự khuôn, trong khi đó một gốc Thymine t trên vector tách dòng pCR2.1. Điều này cho phép sản phẩm PCR có th
dàng hơn khi có mặt enzyme xúc tác.
Sơ đồ cấu tạo vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen)
ng bộ Kit theo vector pCR2.1 của hãng Invitrogen. Tr ng rồi ủ ở 220C trong 30 phút.
Thành phần phản ứng gắn đoạn gen vào vector pCR2.1 Tên hóa chất Thể tích
n phẩm PCR 4µl
ản phẩm phản ứng ng gắn được thực hiện n. Nguyên tắc của phản
m của enzyme Taq
c Thymine tự do được m PCR có thể gắn
TOPO (Invitrogen)
a hãng Invitrogen. Trộn các
Vector pCR2.1-TOPO 1µl Dung dịch đệm 1µl Tổng thể tích 6µl
2.2.1.3.5. Biến nạp plasmid vào E.coli chủng DH5α
Nguyên tắc:
Dựa vào tác dụng của CaCl2, thành tế bào đang ở thời kỳ sinh trưởng trở nên xốp, tạo điều kiện cho ADN có thể chui qua lỗ màng vào tế bào chất khi sốc nhiệt. Sau 30 phút, tế bào sẽ biểu hiện gen kháng kháng sinh có trong plasmid ngoại lai.
Cách tiến hành:
* Chuẩn bị tế bào khả biến
- Tế bào E.coli được nuôi lắc 200 vòng/phút, 370C, qua đêm trong môi trường lỏng.
- Pha loãng dịch nuôi theo tỷ lệ 1% trong môi trường lỏng. Nuôi lắc 200 vòng/phút, 370C. Sau 2 giờ tiến hành kiểm tra mật độ tế bào bằng cách đo OD600, đạt từ 0,6 đến 1 là đạt yêu cầu.
- Chuyển 1ml dịch nuôi sang ống eppendorf vô trùng. - Để trên đá 10 phút.
- Ly tâm 3000 vòng/phút, 40C, 5 phút. Loại bỏ dịch nổi, thu cặn tế bào. - Hòa lại cặn tế bào thành huyền dịch trong 300 µl CaCl2 100mM ở 40C. - Ly tâm 3000 vòng/phút, 40C, 10 phút. Loại dịch nổi, thu cặn tế bào.
- Hòa lại cặn tế bào thành huyền dịch trong 60 µl CaCl2 100 mM giữ trong đá ít nhất 1 giờ trước khi tiến hành biến nạp hoặc bảo quản ở -850C, trong glycerol 15 – 30% để sử dụng dần.
* Biến nạp
- Trộn vector tái tổ hợp (khoảng 10-50 ng) với tế bào trong ống tế bào khả biến, sau đó để trên đá 30 phút.
- Sốc nhiệt ở 42oC, 60 giây. - Đặt trên đá 2 phút.
- Bổ sung 200 l môi trường LB lỏng ở nhiệt độ phòng, nuôi lắc ở 37oC, 1 h. - Cấy trải 100 L mẫu trên môi trường LB đặc (1,5% agar) bổ sung Kanamycin (50 mg/ml).
- Ủ đĩa trong tủ ấm 370C, ít nhất 18 – 20 giờ. * Chọn dòng tế bào tái tổ hợp
Sau khi ủ 18 – 20 giờ, các đĩa thạch được lấy ra để chọn lọc các dòng vi khuẩn tái tổ hợp. Chỉ có khuẩn lạc nào có chứa plasmid đã chuyển nạp thì mới tồn tại được trên môi trường (vì plasmid chuyển nạp thì mới có gen kháng kháng sinh). Chọn các khuẩn lạc mọc riêng rẽ trên đĩa thạch. Sau đó tiếp tục cấy các khuẩn lạc đó trong các ống môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh Kanamycin, lắc trong máy lắc điều nhiệt (200 vòng/phút, 370C) trong 10-20 giờ để các tế bào sinh trưởng và nhân lên với số lượng lớn.
2.2.1.3.6. Phương pháp tách ADN plasmid từ vi khuẩn E. coli
Nguyên tắc:
Việc tách chiết ADN plasmid ra khỏi ADN nhiễm sắc thể là rất khó khăn. Tuy nhiên, người ta có thể dựa vào sự khác biệt lý hóa giữa hai loại ADN như: kích thước, hình thái, cấu trúc của chúng.
Về nguyên tắc được tiến hành theo 3 bước sau:
- Bước 1: Sau khi thu hồi và làm sạch các tế bào có chứa plasmid, xử lý trong hỗn hợp SDS, EDTA hoặc NaOH làm ADN sợi đôi biến tính thành ADN sợi đơn nằm cạnh nhau.
- Bước 2: Xử lý hỗn hợp trên trong môi trường đệm (NaCH3COO+CH3COOH) để kết tủa protein và SDS dạng tập hợp.
- Bước 3: Đưa về môi trường trung tính, ADN sợi đơn được hồi tính trở lại. Còn ADN nhiễm sắc thể do dài nên hồi tính chậm và kết tủa cùng SDS. Tách ADN plasmid bằng cách kết tủa trong isopropanol, sau đó ly tâm tách được plasmid tinh sạch.
Cách tiến hành:
- Hút 1 ml dịch nuôi qua đêm (những khuẩn lạc đã được nuôi cấy ở bước trên) cho vào ống Eppendorf 1,5 ml.
- Ly tâm 6.000 v/p trong 5 phút, thu tế bào. - Bổ sung 150 l Sol I, vortex để hòa tan tế bào. - Bổ sung 150 l Sol II, đảo nhẹ.
- Bổ sung 150 l Sol III, đảo nhẹ.
- Bổ sung 450 l Chloroform: Isoamylalcohol (24 : 1), đảo nhẹ. - Ly tâm 12.000 v/p trong 10 phút.
- Chuyển toàn bộ dịch pha trên sang Eppendorf mới.
- Bổ sung isopropanol theo tỷ lệ 1:1 so với mẫu, tủa ADN plasmid ở -20oC trong thời gian 2 giờ.
- Ly tâm 12.000 v/p trong 20 phút, thu cặn. - Rửa cặn ADN bằng 500 l Ethanol 70%. - Ly tâm 12.000 v/p, 10 phút, thu tủa.
- Làm khô ADN plasmid bằng máy Speed Vac trong 3phút. - Hòa cặn ADN trong 40 l H2O có bổ sung RNAse (100 g/ml). - Điện di để kiểm tra.
2.2.1.3.7. Phương pháp xác định trình tự nucleotide.
Sau khi có sản phẩm plasmid sạch, chúng tôi xác định trình tự nucleic acid theo phương pháp của Sanger (1997). Phương pháp này sử dụng các dideoxynucleotide triphosphat (ddNTP) có đánh dấu huỳnh quang. Các ddNTP chỉ khác với các dNTP ở
chỗ chúng bị mất nhóm OH ở vị trí 3’ nên enzyme ADN Polymeraza không thể kéo dài
mạch từ các phân tử này nữa.
Kết quả phản ứng tổng hợp nên các đoạn ADN dài ngắn khác nhau 1 nucleotide, có thể phân tách nhờ điện di trên gel polyacrylamide, phát hiện các ddNTP bằng cách đặt máy chiếu laze ở đầu tấm điện di, tia sáng sẽ kích hoạt băng điẹn di phát quang cho màu đặc trưng, tín hiệu màu sẽ được truyền vào hệ thống máy điện tử, thông tin sau đó được kết nối với máy tính đã có phần mềm chương trình hóa, thông tin sau đó được kết nối với máy tính đã có phần mềm chương trình hóa, thông tin về màu được đọc thành trình tự bazơ tương ứng, từ đó đưa ra trình tự nucleotide.
2.2.1.4. Phương pháp gắn Aptamer lên hạt nano vàng.
Aptamer được biến đổi thiol hóa đầu 5’- được phản ứng trực tiếp với hạt nano vàng thông qua việc gắn kết các đơn vị thiol lên bề mặt nano vàng; 1mL dung dịch nano vàng trước hết được trộn với 5’-thiol-Aptamer (5uM, 200uL) để nhận được nồng độ sau cùng là 12nM Au và 1uL oligonucleotide.
Ủ hỗn hợp 24 giờ ở nhiệt độ phòng, ly tâm 25 phút ở 16000 vòng/phút để loại bỏ các Aptamer dư. Loại dịch, rửa tủa với 4mM trisodium citrate.
Sau 2 lần rửa, ly tâm các hạt nano vàng-Aptamer được hòa trong 4mM trisodium citrate và bảo quản ở 4oC.
Cuối cùng, Apt-Au được cân bằng với 0,1% BSA, thời gian 120 phút ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng để xác định protein đích.
Các hạt Apt-Au được phủ với BSA hạn chế sự gắn kết không đặc hiệu. Dung dịch Apt-Au được ổn định trong dung dịch 3M NaCl.
2.2.2. Phương pháp gắn Aptamer lên bề mặt điện cực.
Thử nghiệm các phương pháp gắn Aptamer lên bề mặt điện cực, chúng tôi nhận thấy phương pháp gắn “cộng hóa trị” Aptamer lên bề mặt điện cực vàng (điện cực hoạt động) thông qua lớp mỏng trên điện cực vàng đã tạo ra trước có nhiều ưu điểm hơn
việc gắn trực tiếp Aptamer lên bề mặt điện cực. Phương pháp này có tính ổn định cao hơn, đồng thời có thể tái sử dụng điện cực sau khi đo mẫu (chỉ cần loại bỏ liên kết Aptamer với phân tử đích mà không cần chuẩn bị điện cực từ bước đầu tiên). Phương pháp gắn Aptamer lên điện cực bằng liên kết cộng hóa trị qua lớp màng mỏng được biểu lộ theo sơ đồ Hình 2.3.
2.2.2.1. Xử lý và làm sạch điện cực Au
Điện cực Au được mài bóng bằng giấy mài mịn, khăn nhung mịn, rửa sạch bằng nước cất. Điện cực vàng được nhúng 30 phút trong dung dịch piranha (30% H2O2/98% H2SO4, tỉ lệ 1/3). Sau đó rửa bằng nước cất và quét thế vòng trong dung dịch 1 M HCLO4 với khoảng điện thế từ 0 đến 1,5 V, tốc độ quét là 100 mV/giây và chu kỳ quét là 30 cho đến khi đường hoạt hóa có peak rõ nét cân đối, các đường đo lặp lại, rửa sạch bằng nước cất. Xì khô bề mặt bằng luồng khí N2.
2.2.2.2. Tạo lớp MPA trên bề mặt điện cực vàng
Điện cực Au sau khi được xử lý và làm sạch được ngâm trong 20mM MPA (3- Mercaptopropionic acid) pha trong dung dịch ethanol/ nước (v/v:1/3). Thời gian cố định là 3giờ ở nhiệt độ phòng, sau đó rửa điện cực bằng ethanol để loại bỏ các phân tử MPA không gắn kết (Lin et al., 2009).
2.2.2.3. Gắn NHS lên bề mặt điện cực đã xử lý với MPA
Điện cực Au-MPA được ngâm trong dung dịch 100 mM MES (2-(N- morpholino)ethane-sulfonic acid) chứa 20 mM EDC (1-ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) và 20 mM NHS (N-hydroxy- succinimide) để kích hoạt các nhóm carboxyl trên phân tử MPA trong thời gian 15 phút (Geddes et al., 1995).
2.2.2.4. Gắn NH2-Aptamer lên điện cực Au/MPA-NHS
Aptamer được cố định trên phức hệ Au-MPA bằng cách nhúng điện cực Au trong dung dịch 2 nM Aptamer/PBS (10 mM , pH 7,4) thời gian 1h. Điện cực Au sau
khi hoàn tất các giai đoạn trên được tiến hành quét thế vòng (CV-cyclic voltammetry) và sóng vuông (square wave voltammetry -SWV) trong dung dịch điện li (K4Fe(CN)6 5mM + K3Fe(CN)6 5mM + KCl 0.1M). Chế độ điện hóa: U1 = -0,3V, U2=0,9V,
v=0,1V/s, 10 vòng, độ nhạy (sensibility) = 5 để xác định sự thay đổi tín hiệu điện hóa
so với điện cực Au ban đầu.
2.2.2.5. Định lượng HER2 trong mẫu bằng điện cực Au/MPA-NHS
Sau khi cố định Aptamer lên điện cực, điện cực được ngâm trong các dung dịch PBS có chứa HER2 với các nồng độ khác nhau (từ 5 ng/mL đến 500 ng/mL), thời gian ngâm là 30 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó rửa với nước cất. Xác định tổng trở trên thiết bị đo điện hóa.
2.2.2.6. Tái sử dụng điện cực Au/MPA-NHS
Sau khi sử dụng đo (nghĩa là sau mỗi lần đo) định lượng HER2 trong mẫu phân tích, điện cực được ngâm trong đệm PBS, pH = 4,5-5,0 thời gian 10 phút để tách liên kết giữa Aptamer và HER2, rửa 3 lần bằng nước cất. Khi đó, gần như tất cả các phân tử HER2 đã gắn với Aptamer đều được loại bỏ khỏi bề mặt điện cực và điện cực lại có thể
tiếp tục định lượng HER2 trong các mẫu phân tích khác. Để tiết kiệm thời gian khi cần phân tích nhiều mẫu nên chuẩn bị một số điện cực.
2.2.2.7. Đánh giá hoạt động của Aptasensor
Điện cực Au-MPA-Aptamer vừa chế tạo được ngâm trong dung dịch BSA 1X sau đó được chuyển sang dung dịch chứa kháng nguyên HER2 ở các nồng độ khác nhau thời gian 30 phút. Sau khi rửa sạch điện cực với dung dịch PBS 1X, pH 7 để loại bỏ kháng nguyên HER2 không gắn kết, điện cực Au sau khi hoàn tất các giai đoạn trên
được tiến hành quét thế vòng (CV-cyclic voltammetry) và sóng vuông (square wave
voltammetry -SWV) trong dung dịch điện li (K4Fe(CN)6 5mM + K3Fe(CN)6 5mM + KCl 0,1M).
Chế độ điện hóa: U1 = -0.3V, U2=0,9V, v=0,1V/s, 10 vòng, độ nhạy (sensibility)
= 5 để xác định sự thay đổi tín hiệu điện hóa so với điện cực Au ban đầu. Thí nghiệm được lặp lại 5 lần đối với mỗi bước biến đổi bề mặt điện cực cũng như bước xác định nồng độ kháng nguyên trong mẫu.
2.2.3. Phương pháp lai Dot blot
Kháng nguyên HER2 được cố định trên màng nitrocellulose. Màng sau đó được tiến hành block bằng BSA trong thời gian 1h, rửa hai lần với PBS 1X và làm khô. Sau đó màng được nhúng vào dung dịch chứa phức hợp Aptamer-nano vàng, sau khoảng 10 phút quan sát, chúng ta sẽ nhận thấy sự thay đổi màu của vùng được cố định kháng nguyên trên màng bởi màu đỏ đặc trưng của các hạt nano vàng trong dung dịch. Sự gắn kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và Aptamer khiến các hạt nano vàng có gắn Aptamer bị tụ tập lại trên một vùng cố định, sự thay đổi màu của chấm này có thể dễ dàng quan sát bằng mắt thường.
CHƯƠNG III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. SÀNG LỌC APTAMER ĐẶC HIỆU HER2
3.1.1. Kết quả thu nhận và xác định trình tự Aptamer
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR với cặp mồi ApF2/ApR2Ph được trình bày trên Hình 3.1.
Thư viện trước khi đưa vào sàng lọc cho vòng tiếp theo và sản phẩm sau giải hấp được đo nồng độ trên máy Nano Drop để kiểm tra kết quả làm giàu thư viện thứ cấp (Bảng 3.1).
Bảng 3.1. Kết quả đo nồng độ ADN sau sàng lọc ở bước 1
Loại dung dịch Nồng độ ssADN (ng/µL) Dung dịch Apt trước khi sàng lọc 118,65
Dịch qua cột (sau khi ủ với Apt) 2,63 Dịch rửa lần 1 với SB + 0.1% Tween 20 1,85 Dịch rửa lần 2 với SB + 0.1% Tween 20 33,25
Hình 3.1. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR tạo thư viện thứ cấp
100 bp Sản phẩm PCR
Dịch rửa lần 3 với SB + 0.1% Tween 20 71,10 Giải hấp phụ với DMSO 6,95
Dựa trên kết quả đo nồng độ ssADN ta thấy nồng độ dịch đi qua cột sau khi cho Aptamer gắn với kháng nguyên HER2-Ni rất thấp chỉ 2,63 ng/µL.
Kết quả xác định nồng độ Aptamer sau một số vòng sàng lọc được thể hiện ở Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả đo nồng độ (ng/µL) ADN sau các vòng sàng lọc
Vòng sàng lọc
Các phân đoạn 2 3 4 5 9 11 12
Apt sau khi xử lý nhiệt 63,68 8,16 6,55 5,92 16,33 10,67 12,15 Dịch qua cột (sau ủ với
kháng nguyên với Apt) 4,76 2,55 3,01 2,67 2,74 5,4 2,71 Dịch rửa lần 1 5,57 1,42 8,84 1,73 17,8 1,32 1,02 Dịch rửa lần 2 23,09 2,19 9,21 4,81 10,71 0,49 0.35 Dịch rửa lần 3 3,16 2,37 9,2 4,71 3,45 1,52 0,12 Giải hấp phụ với DMSO 6,04 5,82 11,58 10,3 16,28 14,58 8,31
Kết quả điện di sản phẩm PCR sau vòng sàng lọc thứ 12 được trình bày ở Hình 3.2.
Hình 3.2. Kết quả kiểm tra s và sau vòng sàng lọc loại tr
Trên hình 3.2, ta th như trên lý thuyết. Qua đó
Aptamer với phân tử đích sau khi s