- Lò vi sóng - Tủ cấy vô trùng - Máy ly tâm - Tủ lạnh sâu (-200C, -850C) - Máy đo pH - Máy Vortex - Máy soi gel
- Máy hút chân không - Cân phân tích - Máy PCR
- Máy lắc ổn nhiệt 370C - Bể ổn nhiệt
- Pipetman, đầu côn các loại - Cân điện tử
- Máy điện di - Máy Nano Drop
- Các thiết bị khác của phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen. 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Sàng lọc Aptamer đặc hiệu HER2 (Phương pháp SELEX)
2.2.1.1. Chuẩn bị thư viện
* PCR làm giàu thư viện:
Một thư viện ADN sợi đơn có trình tự 5’ – ATC CGT CAC ACC TGC TCT CAT ATG – N40 – ATA CGG GAG CCA ACA CCA AAG CTTC – 3’ nhận từ phòng Công nghệ Tế bào Động vật được sử dụng làm nguyên liệu khởi đầu cho sàng lọc. Tuy
nhiên, lượng phân tử đưa vào cho sàng lọc phải đủ lớn nên thư viện cần được PCR làm giàu.
Cặp mồi đã cải biến sau đây được gắn vào đầu 5’ và 3’ của thư viện để sử dụng cho quá trình khuếch đại: mồi ApF2: 5’ – ATC CGT CAC ACC TGC TCT CAT ATG – 3’ và mồi ApR2Ph: 5’ – Phosphoryl – ATA CGG GAG CCA ACA CCA AAG CTTC – 3’.
Phản ứng PCR được thực hiện với thành phần và chu kỳ như sau:
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR làm giàu thư viện
Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích (μL) Dung dịch đệm 10X 2,5
dNTPs 10 nM 2,5
MgCl2 25 mM 1,25 Mồi xuôi 10 pmol/μL 1 Mồi ngược 10 pmol/μL 1 ADN khuôn 10 – 100 ng/μL 2
Taq-polymeraza 5 unit/μL 0,3
H2O 14,45
Tổng thể tích 25
Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR làm giàu thư viện
Nhiệt độ (0C) 94 94 55 72 72 8
Thời gian 3 phút 45 giây 45 giây 45 giây 8 phút ∞
Sau quá trình khuếch đại, chúng ta thu được một lượng lớn các oligonucleotide 20 chu kỳ
gian để ràng buộc kháng nguyên HER2. Do đó, trước mỗi vòng sàng lọc, sản phẩm
PCR cần được xử lý để tạo sợi đơn ADN. Enzyme lamda exonucleaza là một công cụ
hữu hiệu được sử dụng cho quá trình này. * Cắt ADN sợi đôi thành sợi đơn: Trộn hỗn hợp phản ứng cụ thể như sau:
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng tạo sợi đơn ADN Thành phần Thể tích (μL) Sản phẩm PCR 20 Dung dịch đệm 4 Enzyme 2 H2O 14 Tổng thể tích 40
Sau khi trộn đều các thành phần trên, hỗn hợp được ủ 4 tiếng ở bể ổn nhiệt 370C. Cuối cùng, sợi đơn ADN sẽ được tủa để thu lại. Cách thực hiện như sau:
- 0, 475 μL EDTA 0,5 M và 150 μL ethanol 100% được thêm vào mỗi ống mẫu, giữ ở -200C trong 2,5 h.
- Ly tâm 12000 v/p, 20 phút. Loại dịch nổi, thu cặn. - Bổ sung 30 μL H2O vào mỗi mẫu.
Sau khi thu được sản phẩm sợi đơn oligonucleotide, chúng được xử lý biến tính ở 950C trong 5 phút sau đó ngay lập tức đưa xuống 40C, 15 phút rồi ủ ở 250C trong 7 phút để cuộn gấp cấu trúc thứ cấp đặc thù.
2.2.1.2. Sàng lọc
Quy trình của một vòng sàng lọc như sau:
- Phức hợp protein HER2 – Niken được đưa lên cột.
- Ly tâm 3000 vòng/phút trong 4 phút. Loại dịch. - Bổ sung 250 uL dịch rửa (đêm SB + 0.1% Tween 20)
- Lặp lại bước rửa 3 lần.
- Bổ sung 250 uL đệm giải hấp DMSO.
- Hút dịch, giữ lại làm khuôn cho phản ứng PCR, lặp lại bước chuẩn bị thư viện để tiếp tục vòng sàng lọc sau.
Để theo dõi quá trình làm giàu của các phân tử gắn đặc hiệu với HER2 trong suốt quá trình sàng lọc, thư viện đưa vào và sản phẩm thu được sau giải hấp của mỗi vòng được đo nồng độ trên máy Nano Drop. Tuy nhiên, để hạn chế sự làm giàu của những phân tử thu được sau giải hấp nhưng không đặc hiệu HER2, chúng tôi tiến hành sàng lọc vòng loại trừ.
Hỗn hợp trình tự gắn sau vòng sàng lọc cuối cùng được sử dụng để tách dòng và giải trình tự.
2.2.1.3. Phương pháp tách d
Hình 2.1. Quy trình tách dòng và gi
2.2.1.3.1. Nhân bản Aptamer
Mục đích:
Thu nhận một lượng l được nhân lên nhờ chuỗ cho quá trình tách dòng.
Nguyên tắc
PCR (Polymeraza Chain Reaction
khuếch đại một đoạn ADN đ sợi đôi của đoạn ADN đích v
Biến nạp plasmid
Tách chi
Phương pháp tách dòng và giải trình tự.
Quy trình tách dòng và giải trình tự của những oligonucleotide HER2
Aptamer đặc hiệu với HER2 bằng phương pháp PCR
ng lớn các trình tự ADN gắn đặc hiệu với
ỗi phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu, làm nguyên li
Polymeraza Chain Reaction) là phương pháp in vitro
n ADN đặc thù nhờ công hiệu của 2 mồi oligonucleotide n ADN đích với sự tham gia của ADN Polymeraza.
Nhân bản aptamer đặc hiệu HER2
Phân tích điện di trên gel Agarose
Tinh sạch sản phẩm PCR
Gắn gen vào vector pCR2.1 - TOPO
p plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn E.coli chủng DH
ch chiết plasmid tái tổ hợp từ vi khuẩn E.coli
Xác định trình tự nucleotide nucleotide gắn đặc hiệu ương pháp PCR i HER2, sản phẩm u, làm nguyên liệu in vitro để tổng hợp và nucleotide gắn vào 2 ng DH5α E.coli
Kỹ thuật tổng hợp ADN ngoài cơ thể cũng cần tuân thủ những nguyên tắc cơ bản của sao chép ADN trong cơ thể như: đoạn ADN cần nhân bản phải mở xoắn thành 2 mạch đơn, cần có các cặp mồi (mồi xuôi, mồi ngược), cần nguyên liệu, điều kiện môi
trường thích hợp và enzyme ADN Polymeraza. Tuy nhiên kỹ thuật PCR có khác là
dùng nhiệt độ cao (940C) tháo xoắn thay cho enzyme helicase kết hợp với enzyme
ADN Polymeraza chịu nhiệt và hệ thống nhiệt cho từng giai đoạn phản ứng tổng hợp
cùng với các đoạn mồi được thiết kế chủ động. Nhờ kỹ thuật PCR mà với một lượng nhỏ ADN ban đầu chúng ta có thể thu được đủ lượng ADN cần thiết kế để tiến hành các thí nghiệm về ADN.
Một phản ứng PCR là một chuỗi phản ứng gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn: giai đoạn biến tính, giai đoạn bắt cặp và giai đoạn kéo dài chuỗi.
Cách tiến hành phản ứng PCR
Phản ứng PCR khuếch đại các trình tự gắn sử dụng cặp mồi ApF2/ApR2, thành phần và chu kỳ phản ứng nhau sau:
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại các trình tự gắn Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích (μL) Dung dịch đệm 10X 2,5
dNTPs 10 nM 2,5
MgCl2 25 mM 1,25 Mồi xuôi 10 pmol/μL 1 Mồi ngược 10 pmol/μL 1 ADN khuôn 10 – 100 ng/μL 5
Taq-polymeraza 5 unit/μL 0,3
H2O 11,45
Bảng 2.5. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại các trình tự gắn Nhiệt độ (0C) 94 94 55 72 72 8
Thời gian 3 phút 45 giây 45 giây 45 giây 8 phút ∞
2.2.1.3.2. Phân tích điện di trên gel agarose
Nguyên tắc:
Điện di trên gel agarose thường được sử dụng để xác định sản phẩm PCR dựa trên khả năng phân tách các đoạn ADN có kích thước khác nhau khi sản phẩm PCR di chuyển qua mạng lưới các vi lỗ có trong gel agarose. Nồng độ gel thường phụ thuộc vào kích thước sản phẩm ADN cần phân giải.
Bảng 2.6. Nồng độ gel sử dụng với kích thước ADN tương ứng STT % agarose Kích thước mảnh ADN (kb)
1 0,3 5 – 60 2 0,6 1 – 20 3 0,7 0,8 – 10 4 0,9 0,5 – 7 5 1,2 0,4 – 6 6 1,5 0,2 – 4 7 2,0 0,1 - 3
Do phân tử ADN tích điện âm cao nên khi được đặt trên một điện trường xác định, chúng sẽ di chuyển về phía cực dương của điện trường, trong trường hợp điện di agarose chúng sẽ di chuyển qua gel agarose được đặt trong dung dịch đệm điện di. Các ADN có kích thước càng lớn thì chuyển động càng chậm, các ADN dạng siêu xoắn
cũng chuyển động nhanh hơn ADN dạng thẳng. Trong một phạm vi nhất định của nồng độ gel agarose, kích thước phân tử tuyến tính với quãng đường dịch chuyển của ADN trên gel agarose. Thường các đoạn gen có kích thước từ 300 – 10.000 bp có thể được phân tách trên gel agarose 0,8%. Nguyên tắc này cho phép kỹ thuật điện di phân tách
các đoạn ADN có kích thước khác nhau.
Sản phẩm PCR được trộn với dung dịch đặt mẫu (loading gel) sau đó được chuyển vào các giếng trên gel agarose để thực hiện phân tách dưới tác động của điện trường.
2.2.1.3.3. Phương pháp tinh sạch sản phẩm phản ứng PCR
Thông thường sau khi chạy PCR, trong trường hợp tốt nhất là chỉ có 1 sản phẩm duy nhất (đặc hiệu) thì mẫu vẫn còn bị lẫn tạp với 1 lượng mồi, dNTPs dư và enzyme
ADN Polymeraza. Những chất lẫn tạp này có khả năng ảnh hưởng đến phản ứng giải
trình tự Sanger (sử dụng ddNTP). Để loại bỏ chất lẫn tạp, ta cần thêm bước tinh sạch sản phẩm.
Sản phẩm sau phản ứng PCR được tiến hành tinh sạch theo kit của hãng Qiagen như sau:
Bước 1: Thêm 5 lần thể tích buffer 1 vào sản phẩm PCR, trộn đều.
Bước 2: Chuyển dịch vào cột gắn ADN và ly tâm 12000 vòng/phút, 1 phút. Bước 3: Loại dịch phía dưới cột gắn.
Bước 4: Thêm 500μL buffer 2 vào cột và ly tâm 12000 vòng/phút, 1 phút. Bước 5: Loại dịch phía dưới cột.
Bước 6: Lặp lại bước 4 và bước 5.
Bước 7: Làm khô bằng cách ly tâm tiếp một lần nữa ở 12000 vòng/phút, 1 phút. Bước 8: Thêm 30μL nước vào cột ly tâm 12000 vòng/phút, 1 phút.
Bước 9: Chuyển dịch sau ly tâm sang ống eppendorf mới và bảo quản sản phẩm sau tinh sạch để tiến hành giải trình tự.
2.2.1.3.4. Phản ứng gắn gen v
Nguyên tắc:
Quá trình tách dòng
PCR vào vector tách dòng pCR2.1 với mục đích tạo vector tái t
ứng dựa trên việc tạo ra m mà không phụ thuộc vào trình t
thiết kế trên vector tách dòng pCR2.1. vào vector dễ dàng hơn khi có m
Hình 2.2. Sơ đ Cách tiến hành: Tách dòng sử dụng b thành phần của phản ứng r Bảng 2.7. Thành ph Tên hóa ch Sản ph
ản ứng gắn gen vào vector tách dòng
Quá trình tách dòng được thực hiện bằng cách gắn trực tiếp sả PCR vào vector tách dòng pCR2.1-TOPO (Invitrogen). Phản ứng g
o vector tái tổ hợp mang đoạn ADN mong muốn. Nguyên t o ra một gốc Adenin tự do đầu 3' trên sản phẩm c c vào trình tự khuôn, trong khi đó một gốc Thymine t trên vector tách dòng pCR2.1. Điều này cho phép sản phẩm PCR có th
dàng hơn khi có mặt enzyme xúc tác.
Sơ đồ cấu tạo vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen)
ng bộ Kit theo vector pCR2.1 của hãng Invitrogen. Tr ng rồi ủ ở 220C trong 30 phút.
Thành phần phản ứng gắn đoạn gen vào vector pCR2.1 Tên hóa chất Thể tích
n phẩm PCR 4µl
ản phẩm phản ứng ng gắn được thực hiện n. Nguyên tắc của phản
m của enzyme Taq
c Thymine tự do được m PCR có thể gắn
TOPO (Invitrogen)
a hãng Invitrogen. Trộn các
Vector pCR2.1-TOPO 1µl Dung dịch đệm 1µl Tổng thể tích 6µl
2.2.1.3.5. Biến nạp plasmid vào E.coli chủng DH5α
Nguyên tắc:
Dựa vào tác dụng của CaCl2, thành tế bào đang ở thời kỳ sinh trưởng trở nên xốp, tạo điều kiện cho ADN có thể chui qua lỗ màng vào tế bào chất khi sốc nhiệt. Sau 30 phút, tế bào sẽ biểu hiện gen kháng kháng sinh có trong plasmid ngoại lai.
Cách tiến hành:
* Chuẩn bị tế bào khả biến
- Tế bào E.coli được nuôi lắc 200 vòng/phút, 370C, qua đêm trong môi trường lỏng.
- Pha loãng dịch nuôi theo tỷ lệ 1% trong môi trường lỏng. Nuôi lắc 200 vòng/phút, 370C. Sau 2 giờ tiến hành kiểm tra mật độ tế bào bằng cách đo OD600, đạt từ 0,6 đến 1 là đạt yêu cầu.
- Chuyển 1ml dịch nuôi sang ống eppendorf vô trùng. - Để trên đá 10 phút.
- Ly tâm 3000 vòng/phút, 40C, 5 phút. Loại bỏ dịch nổi, thu cặn tế bào. - Hòa lại cặn tế bào thành huyền dịch trong 300 µl CaCl2 100mM ở 40C. - Ly tâm 3000 vòng/phút, 40C, 10 phút. Loại dịch nổi, thu cặn tế bào.
- Hòa lại cặn tế bào thành huyền dịch trong 60 µl CaCl2 100 mM giữ trong đá ít nhất 1 giờ trước khi tiến hành biến nạp hoặc bảo quản ở -850C, trong glycerol 15 – 30% để sử dụng dần.
* Biến nạp
- Trộn vector tái tổ hợp (khoảng 10-50 ng) với tế bào trong ống tế bào khả biến, sau đó để trên đá 30 phút.
- Sốc nhiệt ở 42oC, 60 giây. - Đặt trên đá 2 phút.
- Bổ sung 200 l môi trường LB lỏng ở nhiệt độ phòng, nuôi lắc ở 37oC, 1 h. - Cấy trải 100 L mẫu trên môi trường LB đặc (1,5% agar) bổ sung Kanamycin (50 mg/ml).
- Ủ đĩa trong tủ ấm 370C, ít nhất 18 – 20 giờ. * Chọn dòng tế bào tái tổ hợp
Sau khi ủ 18 – 20 giờ, các đĩa thạch được lấy ra để chọn lọc các dòng vi khuẩn tái tổ hợp. Chỉ có khuẩn lạc nào có chứa plasmid đã chuyển nạp thì mới tồn tại được trên môi trường (vì plasmid chuyển nạp thì mới có gen kháng kháng sinh). Chọn các khuẩn lạc mọc riêng rẽ trên đĩa thạch. Sau đó tiếp tục cấy các khuẩn lạc đó trong các ống môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh Kanamycin, lắc trong máy lắc điều nhiệt (200 vòng/phút, 370C) trong 10-20 giờ để các tế bào sinh trưởng và nhân lên với số lượng lớn.
2.2.1.3.6. Phương pháp tách ADN plasmid từ vi khuẩn E. coli
Nguyên tắc:
Việc tách chiết ADN plasmid ra khỏi ADN nhiễm sắc thể là rất khó khăn. Tuy nhiên, người ta có thể dựa vào sự khác biệt lý hóa giữa hai loại ADN như: kích thước, hình thái, cấu trúc của chúng.
Về nguyên tắc được tiến hành theo 3 bước sau:
- Bước 1: Sau khi thu hồi và làm sạch các tế bào có chứa plasmid, xử lý trong hỗn hợp SDS, EDTA hoặc NaOH làm ADN sợi đôi biến tính thành ADN sợi đơn nằm cạnh nhau.
- Bước 2: Xử lý hỗn hợp trên trong môi trường đệm (NaCH3COO+CH3COOH) để kết tủa protein và SDS dạng tập hợp.
- Bước 3: Đưa về môi trường trung tính, ADN sợi đơn được hồi tính trở lại. Còn ADN nhiễm sắc thể do dài nên hồi tính chậm và kết tủa cùng SDS. Tách ADN plasmid bằng cách kết tủa trong isopropanol, sau đó ly tâm tách được plasmid tinh sạch.
Cách tiến hành:
- Hút 1 ml dịch nuôi qua đêm (những khuẩn lạc đã được nuôi cấy ở bước trên) cho vào ống Eppendorf 1,5 ml.
- Ly tâm 6.000 v/p trong 5 phút, thu tế bào. - Bổ sung 150 l Sol I, vortex để hòa tan tế bào. - Bổ sung 150 l Sol II, đảo nhẹ.
- Bổ sung 150 l Sol III, đảo nhẹ.
- Bổ sung 450 l Chloroform: Isoamylalcohol (24 : 1), đảo nhẹ. - Ly tâm 12.000 v/p trong 10 phút.
- Chuyển toàn bộ dịch pha trên sang Eppendorf mới.
- Bổ sung isopropanol theo tỷ lệ 1:1 so với mẫu, tủa ADN plasmid ở -20oC trong thời gian 2 giờ.
- Ly tâm 12.000 v/p trong 20 phút, thu cặn. - Rửa cặn ADN bằng 500 l Ethanol 70%. - Ly tâm 12.000 v/p, 10 phút, thu tủa.
- Làm khô ADN plasmid bằng máy Speed Vac trong 3phút. - Hòa cặn ADN trong 40 l H2O có bổ sung RNAse (100 g/ml). - Điện di để kiểm tra.
2.2.1.3.7. Phương pháp xác định trình tự nucleotide.
Sau khi có sản phẩm plasmid sạch, chúng tôi xác định trình tự nucleic acid theo phương pháp của Sanger (1997). Phương pháp này sử dụng các dideoxynucleotide triphosphat (ddNTP) có đánh dấu huỳnh quang. Các ddNTP chỉ khác với các dNTP ở
chỗ chúng bị mất nhóm OH ở vị trí 3’ nên enzyme ADN Polymeraza không thể kéo dài
mạch từ các phân tử này nữa.
Kết quả phản ứng tổng hợp nên các đoạn ADN dài ngắn khác nhau 1 nucleotide,