Nguyên tắc:
Việc tách chiết ADN plasmid ra khỏi ADN nhiễm sắc thể là rất khó khăn. Tuy nhiên, người ta có thể dựa vào sự khác biệt lý hóa giữa hai loại ADN như: kích thước, hình thái, cấu trúc của chúng.
Về nguyên tắc được tiến hành theo 3 bước sau:
- Bước 1: Sau khi thu hồi và làm sạch các tế bào có chứa plasmid, xử lý trong hỗn hợp SDS, EDTA hoặc NaOH làm ADN sợi đôi biến tính thành ADN sợi đơn nằm cạnh nhau.
- Bước 2: Xử lý hỗn hợp trên trong môi trường đệm (NaCH3COO+CH3COOH) để kết tủa protein và SDS dạng tập hợp.
- Bước 3: Đưa về môi trường trung tính, ADN sợi đơn được hồi tính trở lại. Còn ADN nhiễm sắc thể do dài nên hồi tính chậm và kết tủa cùng SDS. Tách ADN plasmid bằng cách kết tủa trong isopropanol, sau đó ly tâm tách được plasmid tinh sạch.
Cách tiến hành:
- Hút 1 ml dịch nuôi qua đêm (những khuẩn lạc đã được nuôi cấy ở bước trên) cho vào ống Eppendorf 1,5 ml.
- Ly tâm 6.000 v/p trong 5 phút, thu tế bào. - Bổ sung 150 l Sol I, vortex để hòa tan tế bào. - Bổ sung 150 l Sol II, đảo nhẹ.
- Bổ sung 150 l Sol III, đảo nhẹ.
- Bổ sung 450 l Chloroform: Isoamylalcohol (24 : 1), đảo nhẹ. - Ly tâm 12.000 v/p trong 10 phút.
- Chuyển toàn bộ dịch pha trên sang Eppendorf mới.
- Bổ sung isopropanol theo tỷ lệ 1:1 so với mẫu, tủa ADN plasmid ở -20oC trong thời gian 2 giờ.
- Ly tâm 12.000 v/p trong 20 phút, thu cặn. - Rửa cặn ADN bằng 500 l Ethanol 70%. - Ly tâm 12.000 v/p, 10 phút, thu tủa.
- Làm khô ADN plasmid bằng máy Speed Vac trong 3phút. - Hòa cặn ADN trong 40 l H2O có bổ sung RNAse (100 g/ml). - Điện di để kiểm tra.