Dung dịch DTT có nồng độ 10-6 mM; Dịch chiết protein bề mặt của tế bào BT 474 để thu kháng nguyên HER2; Dịch chiết protein bề mặt của tế bào HEK293 để thu protein bề mặt; Màng PVDF (Polyvinylidene fluoride), methanol, PBS 1X, TPBS (PBS 1X chứa 0,5% tween20), 2% sữa skim milk được pha trong đệm PBS 1X.
Tạo phức Aptamer-hạt nano vàng (Apt-Au): Biến tính apt ở 93oC, 3 phút, sau đó giảm dần tới nhiệt độ phòng; Bổ sung DTT (10-6 mM), tỉ lệ DTT/Apt là 1:1; Ủ ở nhiệt độ phòng 1-2 giờ; Trộn dung dịch hạt vàng với dịch Aptamer theo tỉ lệ 1:1,1 và ủ lắc ở nhiệt độ phòng 2-3 giờ, sau đó ủ ở 4oC qua đêm.
Qui trình Dot Blot: Ngâm màng PVDF trong đệm methanol 100% trong 5 phút; Rửa lại màng với đệm PBS 1X; Nhỏ protein kháng nguyên lên màng (hàm lượng 250 µg); Ủ màng với đệm sữa 2%, lắc nhẹ 30 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó ủ ở 4oC qua đêm; Rửa lại màng với đệm PBS 1X; Ủ màng với Apt-Au, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng trong 3 giờ; Rửa lại màng bằng đệm TPBS; Kiểm tra kết quả; Mẫu đối chứng sử dụng hạt nano vàng (Au) thay cho phức hệ Apt-Au.
Trên hình 3.8, ta thấy chỉ mẫu chứa Apt-Au xuất hiện mầu tía (mầu của hạt nano vàng), nghĩa là có sự bắt cặp và gắn kết giữa phức hệ Apt-Au với kháng nguyên HER2 đã gắn trên màng, trong khi đó mẫu chỉ có hạt vàng không xuất hiện mầu. Như vậy, Aptamer đã thu nhận có sự gắn kết đặc hiệu với kháng nguyên HER2 thu nhận từ tế bào BT474.
Thí nghiệm 1: Hai màng Dot Blot được phủ kháng nguyên tách từ tế bào BT 474.
Kết quả cho thấy sự khác biệt giữa mẫu Apt-Au (hạt nano vàng có gắn Aptamer) và mẫu Au (hạt vàng không gắn Aptamer) (Hình 3.8).
Hình 3.8. Kết quả Dot Blot giữa mẫu hạt vàng có gắn Aptamer và hạt vàng không gắn Aptamer.
Thí nghiệm 2: màng Dot Blot được cố định hai loại protein khác nhau thu tách tế
bào BT474 và HEK 293, sau đó ủ màng với phức hệ Apt-Au (Hình 3.9). Sau thời gian ủ, kết quả cho thấy chỉ có vị trí cố định protein tách tế bào BT 474 có xuất hiện màu, còn vị trí cố định protein tách tế bào HEK 293 không xuất hiện màu. Kết quả này một lần nữa chứng minh tính đặc hiệu của Aptamer đã thu nhận với HER2, hay tế bào biểu hiện mạnh HER2.
Hình 3.9. Kết quả Dot Blot tính đặc hiệu của Aptamer với HER2
Như vậy: Kết quả kiểm tra bằng kỹ thuật Dot blot đã chứng minh rằng Aptamer-1 đã thu nhận có sự gắn kết đặc hiệu với kháng nguyên HER2 (phức hệ Apt-Au chỉ có phản ứng với các protein tách từ tế bào BT474 là tế bào biểu hiện mạnh HER2 trên bề mặt mà không có phản ứng với các protein tách từ tế bào HEK293 hoặc tế bào MCF7 là các dòng tế bào không biểu hiện hoặc là biểu hiện rất yếu HER2 trên bề mặt.