Nguyên tắc:
Dựa vào tác dụng của CaCl2, thành tế bào đang ở thời kỳ sinh trưởng trở nên xốp, tạo điều kiện cho ADN có thể chui qua lỗ màng vào tế bào chất khi sốc nhiệt. Sau 30 phút, tế bào sẽ biểu hiện gen kháng kháng sinh có trong plasmid ngoại lai.
Cách tiến hành:
* Chuẩn bị tế bào khả biến
- Tế bào E.coli được nuôi lắc 200 vòng/phút, 370C, qua đêm trong môi trường lỏng.
- Pha loãng dịch nuôi theo tỷ lệ 1% trong môi trường lỏng. Nuôi lắc 200 vòng/phút, 370C. Sau 2 giờ tiến hành kiểm tra mật độ tế bào bằng cách đo OD600, đạt từ 0,6 đến 1 là đạt yêu cầu.
- Chuyển 1ml dịch nuôi sang ống eppendorf vô trùng. - Để trên đá 10 phút.
- Ly tâm 3000 vòng/phút, 40C, 5 phút. Loại bỏ dịch nổi, thu cặn tế bào. - Hòa lại cặn tế bào thành huyền dịch trong 300 µl CaCl2 100mM ở 40C. - Ly tâm 3000 vòng/phút, 40C, 10 phút. Loại dịch nổi, thu cặn tế bào.
- Hòa lại cặn tế bào thành huyền dịch trong 60 µl CaCl2 100 mM giữ trong đá ít nhất 1 giờ trước khi tiến hành biến nạp hoặc bảo quản ở -850C, trong glycerol 15 – 30% để sử dụng dần.
* Biến nạp
- Trộn vector tái tổ hợp (khoảng 10-50 ng) với tế bào trong ống tế bào khả biến, sau đó để trên đá 30 phút.
- Sốc nhiệt ở 42oC, 60 giây. - Đặt trên đá 2 phút.
- Bổ sung 200 l môi trường LB lỏng ở nhiệt độ phòng, nuôi lắc ở 37oC, 1 h. - Cấy trải 100 L mẫu trên môi trường LB đặc (1,5% agar) bổ sung Kanamycin (50 mg/ml).
- Ủ đĩa trong tủ ấm 370C, ít nhất 18 – 20 giờ. * Chọn dòng tế bào tái tổ hợp
Sau khi ủ 18 – 20 giờ, các đĩa thạch được lấy ra để chọn lọc các dòng vi khuẩn tái tổ hợp. Chỉ có khuẩn lạc nào có chứa plasmid đã chuyển nạp thì mới tồn tại được trên môi trường (vì plasmid chuyển nạp thì mới có gen kháng kháng sinh). Chọn các khuẩn lạc mọc riêng rẽ trên đĩa thạch. Sau đó tiếp tục cấy các khuẩn lạc đó trong các ống môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh Kanamycin, lắc trong máy lắc điều nhiệt (200 vòng/phút, 370C) trong 10-20 giờ để các tế bào sinh trưởng và nhân lên với số lượng lớn.