Họ thuốc nhuộm azo và các sản phẩm phân hủy thứ cấp có vòng thơm mang nhóm amine độc và gây đột biến đối với các cơ thể sống.
Các thuốc nhuộm hữu cơ nói chung được xếp loại từ ít độc đến không độc đối với con người được đặc trưng bằng chỉ số LD50. Các kiểm tra về tính kích thích da, mắt cho thấy đa số thuốc nhuộm không gây kích thích với vật thử nghiệm (thỏ) ngoại trừ một số cho kích thích nhẹ.
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền
một số màu azo, chủ yếu là thuốc nhuộm benzidin, có tác hại gây ung thư. Các nhà sản xuất châu Âu đã ngừng sản xuất loại này, nhưng trên thực tế chúng vẫn được tìm thấy trên thị trường do giá thành rẻ và hiệu quả nhuộm màu cao.
Thử nghiệm trên cá của hơn 3000 thuốc nhuộm được sử dụng thông thường cho thấy thuốc nhuộm nằm trong tất cả các nhóm từ không độc, độc vừa, độc, rất độc đến cực độc. Trong đó có khoảng 37% thuốc nhuộm gây độc vừa đến độc cho cá và thủy sinh, chỉ 2% thuốc nhuộm ở mức độ rất độc và cực độc cho cá và sinh vật thủy sinh.
Khi đi vào nguồn nước nhận như sông, hồ, v.v. với một nồng độ rất nhỏ thuốc nhuộm đã cho cảm nhận về màu sắc. Thuốc nhuộm hoạt tính sử dụng càng nhiều thì màu nước thải càng đậm. Màu đậm của nước thải cản trở sự hấp thụ oxy và ánh sáng mặt trời, gây bất lợi cho sự hô hấp, sinh trưởng của các loài thủy sinh vật. Nó tác động xấu đến khả năng phân giải của vi sinh đối với các chất hữu cơ trong nước thải. Các nghiên cứu cho thấy khả năng phân giải trực tiếp thuốc nhuộm hoạt tính bằng vi sinh rất thấp. Ở Việt Nam, qua số liệu điều tra tại các công ty dệt may lớn đều cho thấy màu nước thải dệt nhuộm chủ yếu do thuốc nhuộm hoạt tính và một phần do các loại thuốc nhuộm không tan hết khác gây ra.
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền
CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu và phƣơng pháp
2.1.1. Vật liệu
Sáu mươi mẫu nấmtừ gỗ mục, gỗ tươiđã được thu thập từ rừng Quốc gia Bidoup- Núi Bà tỉnh Lâm Đồng để phân lập sàng lọc các chủng nấm có khả năng sinh enzyme ngoại bào vàdựa vào màu chỉ thị xuất hiện ở môi trường phân lập để chọn các chủng sinh laccase.
2.1.2. Hóa chất
Hóa chất sử dụng để nghiên cứu là các hóa chất các hóa chất tinh khiết, đảm bảo chất lượng như ABTS, guaiacol, catechol, veratryl alcohol, VIO, các hóa chất sinh học phân tử v.v của các hãng Sigma, Merk, Aldrich và các hóa chất thông thường có xuất xứ từ Trung Quốc, Việt Nam.
Cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR:
ITS1: 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ ITS4: 5’-TCCTCCGCTTATTGATATG-3’
2.1.3. Thiết bị
Các thiết bị chính bao gồm: cân kỹ thuật Navigator (Ohaus), máy đo pH Hanna (Mỹ), tủ cấy vô trùng Laminar (Pháp), tủ sấy Lenton Themal (Anh), nồi khử trùng ACP (Nhật Bản),máy chu trình nhiệt, máy xác định trình tự gen tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer, máy điện di DNA (Bio-Rad), máy nuôi lắc ở các nhiệt độ 30oC, 37oC, tủ nuôi ổn nhiệt, máy ly tâm Eppendorf (Đức), tủ lạnh các loại 4oC, - 20o, máy đo quang phổ Novaspec II (Đức), lò vi sóng, pipet của hãng Eppendorf, bình tam giác, đầu côn, ống ly tâm v.v.
2.1.4. Các môi trường nuôi cấy
Các môi trường khác nhau gồm TSH1, PDA, PBD, Czapek, MEG, GYMP, Vis, Mechi sử dụng trong nghiên cứu được khử trùng ở 115ºC trong 30 phút trước khi sử
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phân lập các chủng nấm sinh enzyme ngoại bào
Sáu mươi mẫu nấm đã được thu thập từ vườn quốc gia Bidoup- Núi Bà thuộc tỉnh Lâm Đồng. Các mẫu này được bảo quản trong các dụng cụ vô trùng và phân tích ngay sau khi thu mẫu từ 3h đến 120h. Xác định hoạt tính enzyme ngoại bào đã được tiến hành cùng lúc với phân lập nấm trên các môi trường thạch có chất chỉ thị. PDA là môi trường được sử dụng để phân lập các mẫu nấm tươi này. Những năm gần đây, guaiacol và syringaldazine bổ sung vào môi trường như các chất chỉ thị để quan sát sự xuất hiện màu xung quanh sự phát triển của vi sinh vật. Trong thí nghiệm này, guaiacol 0,01% được bổ sung vào môi trường PDA rắn, enzyme ngoại bào được tiết ra và phản ứng với guaiacol tạo thành màu nâu đỏ trên đĩa thạch.
Mẫu nấm đảm được cắt nhỏ với kích thước khoảng 0,5 x 0,5 cm sau đó đặt lên đĩa thạch có chứa sẵn môi trường PDA bổ sung guaicol để làm chất chỉ thị và các đĩa thạch này được nuôi ở 30 0C trong thời gian 2 – 4 ngày. Chọn các chủng nấm tạo thành màu nâu đỏ trên đĩa thạch tiến hành tách riêng và làm sạch.
2.2.2. Sàng lọc các chủng nấm sinh enzyme ngoại bào
Từ các chủng nấm đã được làm sạch, ta sẽ tiến hành sàng lọc khả năng sinh các enzyme ngoại bào khác nhau. Môi trường sử dụng trong thí nghiệm (TSH1): dịch chiết khoai tây: 200 g/l, glucose: 10 g/l, cám: 0,1%, bột đậu tương 0,5% và Cu2+
: 0,1 mM trong bình tam giác 250 ml ở 300C và 200 rpm. Hoạt tính laccase của các chủng nấm được xác định sau từng ngày nuôi cấy [6].
2.2.3. Phương pháp thu dịch laccase trên môi trường lên men lỏng để xác định hoạt tính tính
Laccase trong các bình nuôi cấy được thu trong tủ cấy vô trùng Laminar (Pháp), thao tác thực hiện bên ngọn lửa đèn cồn. Với các thiết bị sử dụng để thu dịch là pipet 1000µl, các đầu tuýp 1ml và Eppendoft (Đức) 1,5-2ml. Dùng pipet đã gắn đầu tuýp hút dịch enzyme trong các bình môi trường chứa chủng nấm vào các eppendoft, sau đó
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền
đem ly tâm ở 12000v/p tại 4ºC trong 10 phút, dịch nổi thu được sử dụng để xác định hoạt tính laccase.
2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính laccase
Nguyên tắc: Dựa trên sự oxy hóa ABTS của laccase tạo thành hợp chất hấp thụ ở bước sóng 420 nm, ở điều kiện thí nghiệm.
Định nghĩa: Một đơn vị hoạt độ laccase là lượng laccase cần thiết để tạo thành 1µM sản phẩm từ ABTS trong thời gian 1 phút, ở điều kiện thí nghiệm.
Thành phần phản ứng:
Thành phần phản ứng Mẫu đối chứng (µl) Mẫu thí nghiệm (µl)
Đệm natri axetat 20mM (pH 3) 800 600 Dịch laccase 0 200 ABTS 1 mM 200 200 Công thức tính: U= E f pu V D V OD OD 0) 106 (
Trong đó: U: Hoạt độ laccase (U/l)
: hệ số hấp thụ ánh sáng của sản phẩm ở bước sóng 420nm (420= 36 000 M-1cm-1)
,kkVpư: Tổng thể tích phản ứng (1 ml) VE: Thể tích laccase (0,2 ml)
ODτ: Giá trị OD đo được tại thời điểm
OD: Giá trị OD đo được tại thời điểm =0 Df: Độ pha loãng
2.2.5. Phân loại chủng nấm
2.2.5.1. Phân loại theo phương pháp truyền thống
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền
thái của khuẩn lạc trên môi trường nuôi cấy và làm tiêu bản để quan sát cuống sinh bào tử trên kính hiển vi quang học.
2.2.5.2 Phân loại bằng phương pháp xác định và so sánh trình tự vùng ITS
Tách DNA tổng số từ nấm
Chủng nấm FBD154 được nuôi cấy trên môi trường PDA đến khi đủ lượng sinh khối để tách DNA. Quá trình tách và thu nhân DNA tổng số được thực hiện theo phương pháp của Sambrook và Russell (2001). Các bước thực hiện được trình bày ở phụ lục 3.
Khuếch vùng trình tự ITS
Cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự ITS là ITS1-ITS4. Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt được trình bày ở phụ lục 4 và 5.
2.2.5.3. Phương pháp xác định trình tự vùng ITS
Cặp mồi ITS1 và ITS4 được sử dụng để nhân vùng trình tự ITS1 - 5,8 S - ITS2 từ DNA tổng số của chủng FBD154. Sản phẩm DNA sau khi đã được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR được làm sạch bằng kit QIAGen. Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được xác định trình tự trực tiếp bằng máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Data Collection V1.0 và Sequencing Analysts. Trình tự các đoạn gen được xử lý bằng phần mềm FinchTV và so sánh với các trình tự đã được công bố trên GenBank (NCBI database). Cây phát sinh chủng loại được xây dựng bằng phần mềm MEGA 6.06.
2.2.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp laccase hợp laccase
Môi trường có khả năng sinh laccase cao nhất được chọn lọc theo các yếu tố sau:
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền
2.2.6.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy
Các môi trường nuôi cấy nấm khác nhau gồm: PDB, GYMP, Czapek, Mechi, TSH1, VIS được sử dụng trong nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh laccase của chủng FBD154.
2.2.6.2. Ảnh hưởng của các chất cảm ứng
Các hợp chất gồm: tyrosine, vanilin, veratryl alcohol, galic acid, CuSO4, FeSO4 , NiCl2với nồng độ 1 mM đã được sử dụng như là các chất cảm ứng để đánh giá sự ảnh hưởng đến sinh tổng hợp laccase của FBD154.
2.2.6.3. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy
Dải pH 2-11 đã được sử dụng để đánh giá khả năng sinh trưởng và sinh laccase trên môi trường TSH1 của chủng nấm FBD154. Đánh giá sự thay đổi hoạt tính enzyme theo thời gian từ sau một ngày nuôi cấy cho đến khi hoạt tính enzyme giảm đã được tiến hành.
2.2.6.4. Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Nguồn cacbon là glucose trong môi trường TSH1 được thay thế bởi xylose, saccharose, rỉ đường, mannose, lactose với nồng độ 10 g/l được sử dụng để nghiên cứu ảnh hưởng của chúng lên khả năng sinh laccase của chủng nấm FBD154. Ngoài ra còn có 1 thí nghiệm không sử dụng nguồn cacbon cũng được tiến hành để khảo sát. Thí nghiệm thực hiện trong bình tam giác 250 ml và được nuôi lắc 200 vòng/phút ở 30o
C. Nguồn cacbon được lựa chọn sẽ được khảo sát theo dãy nồng độ để tìm ra nồng độ thích hợp cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.2.6.5. Ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ
Nguồn nitơ vô cơ là NaNO3, (NH4)2SO4, KNO3, NH4NO3, NH4Cl với nồng độ ban đầu là 2 g/l được bổ sung vào môi trường để khảo sát ảnh hưởng của chúng lên khả năng sinh tổng hợp laccase bởi chủng nấm FBD154.
2.2.6.6. Ảnh hưởng của nguồn nitơ hữu cơ
Nguồn nitơ hữu cơ trong môi trường được thay thế bởi cao malt, cao nấm men, cao thịt, peptone, tripton và casein với nồng độ ban đầu là 1g/l để đánh giá hoạt tính
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền
laccase sinh ra bởi chủng nấm FBD154.
2.2.7. Đánh giá hiệu quả loại màu thuốc nhuộm hoạt tính bằng laccase thô từ chủng nấm FBD154 chủng nấm FBD154
Dịch enzyme có nồng độ cuối 1000 U/l được sử dụng để đánh giá khả năng loại màu với sự tham gia của chất gắn kết. Chất gắn kết sử dụng là VIO (violuric acid), HBT (Hydroxybenzotriazole), Si (Sinapic acid) , Ace (Acetoncysing)), Syr (Syringaldehyde). Các thuốc nhuộm hoạt tính sử dụng để đánh giá hiệu quả loại màu bằng laccase thô gồm các màu thuộc nhóm Anthraquinone (RBBR, NY5)và nhóm azo (NY1, NY7) với bước sóng hấp thụ cực đại tương ứng 595, 595 và 520, 499 nm. Màu thương mại (LF-2B, CLS)có bước sóng hấp thụ cực đại tương ứng là 550, 600 nm.Tổng thể tích phản ứng loại màu là 5 ml gồm: đệm natri axetat 20 mM pH 4, thuốc nhuộm (nồng độ 100 mg/l), dịch enzyme thô (nồng độ cuối 1000 U/l) và chất gắn kết (nồng độ cuối 200 µM). Nồng độ gốc của các thuốc nhuộm là 3g/l và nồng độ trong phản ứng loại màu là 100 ppm. Mẫu đối chứng có màu và đệm natri axetat pH 4. Thành phần và thể tích phản ứng enzyme thể hiện ở phụ lục 2.
Hiệu quả loại màu thuốc nhuộm được đánh giá trong 24 giờ. Dịch phản ứng chứa lần lượt các màu được đo tại các bước sóng phù hợp. Khả năng loại màu được xác định bằng phần trăm hấp phụ của chất khử bằng công thức:
Ai
At Ai
D 100( )
Trong đó D: phần trăm loại màu thuốc nhuộm (%) Ai: Độ hấp thụ ban đầu
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập các chủng nấm sinh enzyme ngoại bào
Từ 60 mẫu nấm thu thập từ vườn quốc gia Bidoup – Núi Bà thuộc tỉnh Lâm Đồng đã phân lập được 38 mẫu.
Hầu hết các nấm thu được này chỉ đo được laccase, LiP và MnP đo được ở rất ít mẫu, đa phần là không phát hiện được. Trong 60 mẫu nấm, thì nấm mềm và dai có hoạt tính laccase cao hơn so với các loại nấm cứng bởi vì nấm mềm và dai dễ nghiền nát hơn các nấm cứng nên các enzyme ngoại bào dễ dàng xác định hơn. Hoạt tính enzyme tự nhiên của nấm còn phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng khác nhau của nấm. Tuy nhiên số liệu thu được cũng giúp các nhà nghiên cứu định hướng cho các nghiên cứu sâu hơn đối với từng chủng.
Hình 3.1. Hoạt tính tự nhiên của các mẫu nấm từ Bidoup
Trong 60 mẫu nấm thu thập từ vườn Quốc gia Bidoup- Núi Bà chỉ có 38/60 mẫu nấm thu được có thể nghiền để xác định hoạt tính vì có một số loại nấm quá rắn không thể nghiền được. Trong số 38 mẫu xác định hoạt tính laccase, LiP và MnP thì 17/38 đo được laccase tự nhiên với hoạt tính dao động từ 5 – 496 U/l. Không giống như laccase,
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền
được từ xác định enzyme ngoại bào tự nhiên góp phần cung cấp cho ta thông tin quan trọng về sự hiện diện của cả 3 enzyme laccase MnP và LiP và hơn hết là để tập trung vào một số chủng có tiềm năng sinh enzyme ngoại bào có hoạt tính cao.
3.2. Sàng lọc các chủng nấm sinh enzyme ngoại bào
Tỷ lệ làm sạch nấm ở mức chấp nhận được, cụ thể là 38/60 mẫu nấm đảm đã được làm sạch. Để tránh bỏ sót các mẫu nấm sinh enzyme nhưng không đo được trong mẫu tự nhiên việc phân lập trên môi trường chất chỉ thị đã giúp khắc phục nhược điểm này. Trên môi trường thạch sàng lọc chứa chất chỉ thị guaiacol, enzyme ngoại bào oxy hóa chất này tạo nên vùng nâu đỏ sau từ 1-5 ngày nuôi cấy. Chỉ thị này chứng tỏ các chủng nấm này có khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào thuộc nhóm peroxidase (LiP và MnP) hoặc laccase (Bảng 3.1.).
Bảng 3.1. Các chủng nấm sinh enzym ngoại bào
Tên nấm Tạo vùng nâu đỏ Tên nấm Tạo vùng nâu đỏ Tên nấm Tạo vùng nâu đỏ FBD100 - FBD118 - FBD138 - FBD101 - FBD121 + FBD140 + FBD105 - FBD122 + FBD141 + FBD106 + FBD125 + FBD143 + FBD107 + FBD126 + FBD145 + FBD108 + FBD127 - FBD146 + FBD109 + FBD130 - FBD148 - FBD110 - FBD131 - FBD150 + FBD111 + FBD132 + FBD152 + FBD113 + FBD133 + FBD154 + FBD114 + FBD135 - FBD157 - FBD116 - FBD137 + FBD158 + FBD117 + FBD161 -
Chú thích: (+): Tạo vùng nâu đỏ trên PDA chứa guaiacol, (-) Không tạo vùng nâu đỏ trên PDA chứa guaiacol
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền
ngoại bào. Có tới 12 mẫu tạo vòng nâu đỏ nhưng không xác định được hoạt tính enzyme tự nhiên. Kết quả này một lần nữa chỉ ra rằng việc nghiền mẫu ban đầu để xác định hoạt tính tự nhiên rất quan trọng và môi trường phân lập định hướng cũng giúp chúng ta phần nào cải thiện được hiệu suất phân lập nấm đảm sinh enzyme laccase, MnP và LiP.
Bảy chủng nấm xuất hiện vùng nâu đỏ có đường kính to và đậm trên môi trường PDA chứa guaiacol 0,01 % đã được chọn để thử hoạt tính trên môi trường TSH1. Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Hoạt tính laccase và hình ảnh khuẩn lạc của 7 chủng nấm trên môi trường PDA
STT TÊN