2.2.7. Đánh giá hiệu quả loại màu thuốc nhuộm hoạt tính bằng laccase thô từ chủng nấm FBD154 chủng nấm FBD154
Dịch enzyme có nồng độ cuối 1000 U/l được sử dụng để đánh giá khả năng loại màu với sự tham gia của chất gắn kết. Chất gắn kết sử dụng là VIO (violuric acid), HBT (Hydroxybenzotriazole), Si (Sinapic acid) , Ace (Acetoncysing)), Syr (Syringaldehyde). Các thuốc nhuộm hoạt tính sử dụng để đánh giá hiệu quả loại màu bằng laccase thô gồm các màu thuộc nhóm Anthraquinone (RBBR, NY5)và nhóm azo (NY1, NY7) với bước sóng hấp thụ cực đại tương ứng 595, 595 và 520, 499 nm. Màu thương mại (LF-2B, CLS)có bước sóng hấp thụ cực đại tương ứng là 550, 600 nm.Tổng thể tích phản ứng loại màu là 5 ml gồm: đệm natri axetat 20 mM pH 4, thuốc nhuộm (nồng độ 100 mg/l), dịch enzyme thô (nồng độ cuối 1000 U/l) và chất gắn kết (nồng độ cuối 200 µM). Nồng độ gốc của các thuốc nhuộm là 3g/l và nồng độ trong phản ứng loại màu là 100 ppm. Mẫu đối chứng có màu và đệm natri axetat pH 4. Thành phần và thể tích phản ứng enzyme thể hiện ở phụ lục 2.
Hiệu quả loại màu thuốc nhuộm được đánh giá trong 24 giờ. Dịch phản ứng chứa lần lượt các màu được đo tại các bước sóng phù hợp. Khả năng loại màu được xác định bằng phần trăm hấp phụ của chất khử bằng công thức:
Ai
At Ai
D 100( )
Trong đó D: phần trăm loại màu thuốc nhuộm (%) Ai: Độ hấp thụ ban đầu
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập các chủng nấm sinh enzyme ngoại bào
Từ 60 mẫu nấm thu thập từ vườn quốc gia Bidoup – Núi Bà thuộc tỉnh Lâm Đồng đã phân lập được 38 mẫu.
Hầu hết các nấm thu được này chỉ đo được laccase, LiP và MnP đo được ở rất ít mẫu, đa phần là không phát hiện được. Trong 60 mẫu nấm, thì nấm mềm và dai có hoạt tính laccase cao hơn so với các loại nấm cứng bởi vì nấm mềm và dai dễ nghiền nát hơn các nấm cứng nên các enzyme ngoại bào dễ dàng xác định hơn. Hoạt tính enzyme tự nhiên của nấm còn phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng khác nhau của nấm. Tuy nhiên số liệu thu được cũng giúp các nhà nghiên cứu định hướng cho các nghiên cứu sâu hơn đối với từng chủng.
Hình 3.1. Hoạt tính tự nhiên của các mẫu nấm từ Bidoup
Trong 60 mẫu nấm thu thập từ vườn Quốc gia Bidoup- Núi Bà chỉ có 38/60 mẫu nấm thu được có thể nghiền để xác định hoạt tính vì có một số loại nấm quá rắn không thể nghiền được. Trong số 38 mẫu xác định hoạt tính laccase, LiP và MnP thì 17/38 đo được laccase tự nhiên với hoạt tính dao động từ 5 – 496 U/l. Không giống như laccase,
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền
được từ xác định enzyme ngoại bào tự nhiên góp phần cung cấp cho ta thông tin quan trọng về sự hiện diện của cả 3 enzyme laccase MnP và LiP và hơn hết là để tập trung vào một số chủng có tiềm năng sinh enzyme ngoại bào có hoạt tính cao.
3.2. Sàng lọc các chủng nấm sinh enzyme ngoại bào
Tỷ lệ làm sạch nấm ở mức chấp nhận được, cụ thể là 38/60 mẫu nấm đảm đã được làm sạch. Để tránh bỏ sót các mẫu nấm sinh enzyme nhưng không đo được trong mẫu tự nhiên việc phân lập trên môi trường chất chỉ thị đã giúp khắc phục nhược điểm này. Trên môi trường thạch sàng lọc chứa chất chỉ thị guaiacol, enzyme ngoại bào oxy hóa chất này tạo nên vùng nâu đỏ sau từ 1-5 ngày nuôi cấy. Chỉ thị này chứng tỏ các chủng nấm này có khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào thuộc nhóm peroxidase (LiP và MnP) hoặc laccase (Bảng 3.1.).
Bảng 3.1. Các chủng nấm sinh enzym ngoại bào
Tên nấm Tạo vùng nâu đỏ Tên nấm Tạo vùng nâu đỏ Tên nấm Tạo vùng nâu đỏ FBD100 - FBD118 - FBD138 - FBD101 - FBD121 + FBD140 + FBD105 - FBD122 + FBD141 + FBD106 + FBD125 + FBD143 + FBD107 + FBD126 + FBD145 + FBD108 + FBD127 - FBD146 + FBD109 + FBD130 - FBD148 - FBD110 - FBD131 - FBD150 + FBD111 + FBD132 + FBD152 + FBD113 + FBD133 + FBD154 + FBD114 + FBD135 - FBD157 - FBD116 - FBD137 + FBD158 + FBD117 + FBD161 -
Chú thích: (+): Tạo vùng nâu đỏ trên PDA chứa guaiacol, (-) Không tạo vùng nâu đỏ trên PDA chứa guaiacol
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền
ngoại bào. Có tới 12 mẫu tạo vòng nâu đỏ nhưng không xác định được hoạt tính enzyme tự nhiên. Kết quả này một lần nữa chỉ ra rằng việc nghiền mẫu ban đầu để xác định hoạt tính tự nhiên rất quan trọng và môi trường phân lập định hướng cũng giúp chúng ta phần nào cải thiện được hiệu suất phân lập nấm đảm sinh enzyme laccase, MnP và LiP.
Bảy chủng nấm xuất hiện vùng nâu đỏ có đường kính to và đậm trên môi trường PDA chứa guaiacol 0,01 % đã được chọn để thử hoạt tính trên môi trường TSH1. Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Hoạt tính laccase và hình ảnh khuẩn lạc của 7 chủng nấm trên môi trường PDA
STT TÊN CHỦNG HOẠT TÍNH TỰ NHIÊN (U/l) HOẠT TÍNH SÀNG LỌC (U/l) MẶT TRƢỚC MẶT SAU 1 FBD106 97 30,54 2 FBD107 6 83 3 FBD111 11 986,65
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền STT TÊN CHỦNG HOẠT TÍNH TỰ NHIÊN (U/l) HOẠT TÍNH SÀNG LỌC (U/l) MẶT TRƢỚC MẶT SAU 4 FBD122 0 14,5 5 FBD145 0 48,92 6 FBD150 0 37,33 7 FBD154 0 4233
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền
Hình 3.2. Hoạt tính laccase của 7 chủng nấm phân lập từ Bidoup – Núi Bà
Hoạt tính laccase của 7 chủng phân lập được dao động rất lớn từ 14,5 đến 4233,1 U/l (Hình 3.2) và chủng FBD154 sinh laccase với hoạt tính cao nhất (4233,1 U/l). Nên chủng FBD154 được chọn để nghiên cứu tiếp theo.