(A) (B) Hình 3.19. Khả năng loại màu thuốc nhuộm CLS (A); LF-2B (B) của dịch enzyme thô của
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền
Hình 3.20. Sự thay đổi màu CLS bởi laccase thô từ chủng Polyporus sp. FBD154 khi có và không có mặt các chất gắn kết
Hình 3.21. Sự thay đổi màu LF-2B bởi laccase thô từ chủng Polyporus sp. FBD154 khi có và không có mặt các chất gắn kết
Khi không bổ sung CGK hiệu suất loại màu CLS tương đối cao 53% sau 3 h và 62% sau 24 h. Laccase thô từ chủng nấm FBD154 khi kết hợp với chất gắn kết có khả năng loại được màu CLS với hiệu suất khá cao đạt từ 56 % đến 87 % sau 24 h. Cũng giống như các màu khác khi có mặt của 2 CGK là Ace và Sy hiệu suất loại màu tăng lên rõ rệt. Sau 5 phút với chất gắn kết là Ace và Sy đã loại được lần lượt là 72 % và 73 % các giờ tiếp theo kết quả này thay đổi không đáng kể.
Với màu LF-2B khi không có mặt của CGK thì hiệu suất loại màu chỉ đạt 18% sau 3h nhưng sau 24 h hiệu suất loại màu thuốc nhuộm này đã là 73%. So với màu CLS thì màu LF-2B có hiệu suất loại màu cao hơn khi sử dụng 2 CGK là Ace và Sy. Sau 5 phút cả 2 CGK này đều loại được 90% màu thương mại LF-2B. Ở các thí nghiệm khác hiệu suất loại không cao sau 5 phút nhưng sau 24 h thì hiệu quả loại màu đã tăng lên rõ rệt và thu được từ 73 đến 94% (Hình 3.21).
Cui và cộng sự cũng đã thông báo laccase từ loài nấm Coriolopsis polyzona có khả năng loại được 73,8% màu acid blue 62; 29,9% màu acid black 194; 55,3% màu reactive black và 44,6% màu direct blue 71 với sự có mặt của 2,5 mM VIO (Cui et al., 2009). Laccase từ Trametes versicolor có tốc độ loại màu thấp (5,67%) với màu
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền
reactive black 5 khi có mặt của HBT ở tỷ lệ màu/ chất gắn kết 1:5, trong khi chỉ một mình laccase không thể loại được [10]. Husseiny (2008) cũng thông báo rằng hai loài nấm sợi Aspergillus niger và Penicillium spp. có khả năng khử màu reactive dye (lần lượt là 74,2% và 77,87%) và direct dye (78,3%; 67,42%) nhưng không đề cập tới khả năng sinh enzyme [32]. Ngoài ra, Khelifi và cộng sự đã chứng minh được chủng
Aspergillus alliaceus 121C loại lần lượt 98,6 và 98% màu Indigo và Congo đỏ sau 9 ngày nuôi và hoạt tính laccase tạo ra 79 U/l [44].
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền
Bảng 3.3. Hiệu suất loại màu của thuốc nhuộm hoạt tính bằng laccase của FBD154 khi có mặt các chất gắn kết khác nhau
Màu Enzyme và CGK
Thời gian Hoạt tính laccase
(U/l) 5 m 30 m 1 h 2 h 3 h 24 h 0 h 24 h RBBR E 15 83 88 93 93 96 1000 677 E + Ace 68 70 71 74 74 82 1000 618 E + Si 5 68 78 82 82 89 1000 784 E + VIO 17 90 91 95 93 96 1000 641 E + HBT 20 91 94 97 95 98 1000 687 E + Sy 74 76 75 77 78 84 1000 729 NY5 E 20 52 59 66 68 75 1000 582 E + Ace 27 44 47 50 52 61 1000 583 E + Si 1 26 40 52 59 73 1000 625 E + VIO 19 60 67 73 74 80 1000 591 E + HBT 17.5 50 61 71 74 80 1000 611 E + Sy 36 54 55 57 59 65 1000 611 NY1 E 57 60 59 60 65 72 1000 883 E + Ace 87 87 86 85 86 89 1000 759 E + Si 19 46 52 54 63 78 1000 910 E + VIO 62 76 82 84 87 89 1000 805 E + HBT 62 75 79 81 84 89 1000 899 E + Sy 85 85 84 84 86 88 1000 578 NY7 E 17 17 18 18 19 46 1000 718 E + Ace 92 90 90 89 88 89 1000 781 E + Si 0 33 56 57 64 83 1000 883 E + VIO 23 48 77 84 88 91 1000 767 E + HBT 18 28 43 60 80 91 1000 745 E + Sy 92 91 92 91 91 92 1000 763 CLS E 3 6 6 53 53 62 1000 724 E + Ace 72 72 73 73 73 77 1000 689 E + Si 1 1 8 27 37 55 1000 770 E + VIO 4 26 52 75 77 87 1000 728 E + HBT 3 14 33 66 69 79 1000 686 E + Sy 73 74 75 75 75 78 1000 679 LF-2B E 1 4 6 13 18 73 1000 922 E + Ace 90 90 90 90 90 90 1000 931 E + Si 0 0 13 62 70 88 1000 921 E + VIO 1 22 36 76 79 85 1000 250 E + HBT 0 18 37 92 92 94 1000 950 E + Sy 91 91 91 91 91 92 1000 797
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền
Bảng 3.4. So sánh hiệu suất loại màu bởi laccase của chủng nấm FBD154 so với laccase thu được của các chủng nấm khác
Laccase Nồng
độ màu
Hiệu suất loại màu Tài liệu tham khảo
Polyporus pseudobetulinus
200 ppm
65% màu Ambifix Blue H3R sau 15 phút và 80% màu Malachite Green sau 24 h.
Songserm et al., 2012 [89] Coriolopsis polyzona 100 ppm
73,8% màu acid blue 62; 29,9% màu acid black 194; 55,3% màu reactive black và 44,6% màu direct blue 71 khi sử dụng laccase có bổ sung 2,5 mM VIO
Cui et al., 2009 [18]
Pycnoporus
sanguineus CS2 25 μM 70% màu Methyl Red và 15% màu Reactive Black 5 sau 4 giờ ở 25ºC Martínez et al., 2013[51] Pycnoporus coccineus BRFM 938 40 ppm 26% Poly R-478, 93% RBBR, 100% Bromocresol purple, 92% Reactive black 5, 100% Acid yellow 17 sau 52 giờ khi bổ sung HBT
Uzan et al., 2010 [95] Trametes versicolor 100 ppm
91,5% Reactive Blue KN-R ở 40oC sau 16 giờ; 68,9% Acid Red 35 ở 50oC sau 24 giờ; 59,7% DirectTurquoise Blue 5B và 68,2% Direct Orange 7 sau 28 giờ ở 40o C Li et al., 2014[47] Lentinus Polychrous 40 ppm
85% Acid Blue 80; 30% Water Blue; 20% Indigo Carmine; ít hơn 10% đối với các màu thuộc nhóm azo (Reactive Black 5, Reactive Orange 16, Reactive Green 19) sau 120 phút. Ratanapongleka, Phetsom, 2014 [71] Funalia trogii 100 ppm
74,96% Reactive Black 171; 78,14 Reactive Black 5 sau 5 phút ở 30o C Yeşİlada et al., 2014[104. Trichoderma sp. FCP3 100 ppm
92% Acid bue 62; 86% Remazol brilliant bue R; 64% Acid blue 281; 60% Acid red 299; 6% Acid red 266 sau 3 giờ Hoang Thị Nhung et al., 2011[4] Trametes sp. SQ01 1000
ppm 30% Remazol brilliant bue R bị loại bỏ trong 30 phút
Xiao et al., 2013 [101] Polyporus sp.FBD154 100 ppm
90% màu Remazol brilliant bue R với CGK là VIO sau 30 phút; 80% màu Acid blue 281 khi có mặt CGK là HBT sau 24 h; 87% màu Acid red 299 với CGK là Ace sau 5 phút; 92% màu Acid red 266, 91% màu Evezol Red và 73% màu Megafix black CLS với CGK là Sy sau 5 phút với nồng độ CGK là 200 µM
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
1. Từ 60 chủng nấm đảm thu thập ở vườn Quốc gia Bidoup- Núi Bà thuộc tỉnh Lâm Đồng đã phân lập được 38 chủng và lựa chọn được chủng FBD154 có khả năng sinh tổng hợp laccase trên môi trường TSH1 có hoạt tính ban đầu cao nhất là 4233 U/l;
2. Chủng FBD154 thuộc lớp nấm đảm Basidiomycetes, chi Polyporusvà được đặt tên là Polyporus sp. FBD154 với mã số đăng ký trên Genbank là KR 920049; 3. Polyporus sp. FBD154 có khả năng sinh tổng hợp laccase cao thời gian nuôi cấy
ngắn ở pH thấp với hoạt tính 74.925 U/l sau 4 ngàytrên môi trường chứa dịch chiết khoai tây 200g/l, casein 1 g/l, cám gạo 1 g/l, bột đậu tương 5 g/l, mannose 10 g/l, CuSO4 0,3 mM, 3 g/l NH4Cl, pH 4 và tốc độ lắc 200 v/phút, ở 30oC; 4. Khi có mặt của 200 µM CGK dịch enzyme thô của chủng đã loại được 90%
màu RBBR ; 80% màu NY5; 87% màu NY1; 92% màu NY7, 91% màu LF-2B và 73% màu CLS . Sau 30 phút hiệu suất loại màu của RBBR, NY1, NY5 lần lượt là 83%, 60%, 52% khi không có mặt CGK;
5. Chủng nấm đảm được phân lập từvườn Quốc gia Bidoup- Núi Bà thuộc tỉnh Lâm Đồng với các đặc tính của laccase khác hẳn so với các công bố quốc tế có mức tương đồng tới 99% với P. arcularius DSH92132, chủng nấm đảm này có tiềm năng cao trong xử lý ô nhiễm môi trường và loại màu thuốc nhuộm. Với các kết quả thu được chủng nấm đảm này đã được chấp nhận đơn đăng ký quyền sở hữ trí tuệ.
Kiến nghị
1. Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp các enzyme ngoại bào khác của chủng FBD154 như chitinase, protease, xylanse v.v.
2. Nghiên cứu một số điều kiện nuôi cấy khác để tiếp tục nâng cao hoạt tính sinh tổng hợp laccase của chủng Polyporus sp. FBD154. Xác định cấu trúc của
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền
laccase do FBD154 tạo ra sau khi đã được làm sạch và nghiên cứu các đặc tính cơ bản của loại enzyme này.
3. Đánh giá khả năng phân hủy dioxin, PCB, PAH và phenol bởi chủng Polyporus
sp. FBD154.
4. Đánh giá khả năng kháng các VSV gây bệnh, sinh tổng hợp các chất kháng nấm của chủng Polyporus sp. FBD154.
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Đào Thị Ngọc Ánh, Đặng Thị Cẩm Hà (2009) Khả năng phân hủy DDT của chủng nấm sợi FNA1 phân lập từ đất nhiễm hỗn hợp thuốc trừ sâu tại Nghệ An. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Thái Nguyên 57(9): 46-51.
2. Đặng Thị Cẩm Hà (2012) Nghiên cứu công nghệ sản xuất enzyme ngoại bào Laccase, Manganese Peroxidase (MnP), Lignin Peroxidase (LiP) từ vi sinh vật phục vụ xử lý các chất ô nhiễm đa vòng thơm. Đề tài độc lập cấp nhà nước176-178.
3. Đặng Thị Thu, Tô Kim Anh, Lê Quang Hòa, Lê Hồng Nga (2009) Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn nấm sợi sinh tổng hợp laccase từ rừng tự nhiên Việt Nam. Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc 376-380.
4. Hoàng Thị Nhung, Đinh Thị Thu Hằng, Đặng Thị Cẩm Hà (2011) Sàng lọc chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp laccase và phân hủy các hợp chất đa vòng thơm, loại màu thuốc nhuộm. Tạp chí Công Nghệ Sinh học11 (2): 265-274
5. Nguyễn Nguyên Quang, Nguyễn Thị Lệ, Nguyễn Bá Hữu, Đặng Thị Cẩm Hà (2010) Phân hủy sinh học các hợp chất vòng thơm và thuốc nhuộm của chủng nấm sợi FBH11 phân lập từ đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại điểm nóng Biên Hòa. Hội nghị Khoa học Kỷ niệm 35 năm thành lập Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Hà Nội 2010: 392- 398.
Tiếng Anh
6. Aktas N., Cicek H., Unal A. T., Kibarer G., Kolankaya N., Tanyolac A (2001) Reaction kinetics for lacasse-catalyzed polymerization of 1-naphthol. Bioresource Technology80 91): 29-36.
7. Arora D.S., Sharma R.K. (2010) Ligninolytic fungal laccases and their biotechnological applications. Appl. Biochem. Biotechnol 160(6): 1760–1788.
8. Arockiasamy S., Krishnan I.P.G., Anandakrishnan N., Seenivasan S., Sambath A., Venkatasubramani J.P (2008) Enhanced production of laccase from Coriolus
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền
versicolor NCIM 996 by nutrient optimization using response surface methodology.
Appl Biochem Biotechnol 151(2-3): 371-379.
9. Bhatnagar A., Sillanpaa M (2010) Utilization of agro-industrial and municipal waste materials as potential adsorbents for water treatment: areview.Chem Eng J157:277- 296.
10. Bibi I. and Bhatti, H.N (2012) Biodecolorization of Reactive Black 5 by laccase mediator system.Afri. Jour Biotech 11(29): 7464-7471
11. Burton S (2003) Laccases and phenol oxidases in organic synthesis. Curr Org Chem7: 1317-1331.
12. Cavallazzi JRP, Kasuya1 CM, Soares MA (2005) Screening of inducers for laccase production by Lentinula edodes in liquid medium. Brazilian J Microb 36: 383-387. 13. Chacko J T., Subramaniam K (2011)Enzymatic degradation of azo dyesa review.
Int J Environ Sci 1:1250-60.
14. Charumathi D., Das N (2012)Packed bed column studies for the removal of synthetic dyes from textile wastwater using immobilised dead C.
TropicalisDesalination 285:22-30.
15. Chang J., Kuo T., Chao Y., Ho J., Lin P (2000)Azo dye decolorization with a mutant Escherichia coli strain. Biotechnol Lett2 (9): 807–812.
16. Chen S.C, Wu P.H, Su Y.C, Wen T.N, Wei Y.S, Wang N.C, Hsu C.A, Wang A.H, Shyur L.F (2012) Biochemical characterization of a novel laccase from the basidiomycete fungus Cerrena sp. WR1. Protein Eng Des. Sel 25(11): 761-9.
17. Couto S.R and Herrera J.L.T (2007) Laccase production at reactor scale by filamentous fungi.Biotech. Adv 25: 558-569.
18. Cui T (2009) Enhanced large-scale production of laccases from Coriolopsis polyzona forusein dye bioremediation. PhD thesis.The University of Westminster. 19. Cullen D (2002) Molecular genetics of lignin-degrading fungi and theirapplications in organopollutant degradation. The Mycota XI Agricultural Application. Springer-
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền
Verlag Berlin Heidelberg.
20. Daâssi D., Rodríguez-Couto S., Nasri M., Mechichi T (2014) Biodegradation of textile dyes by immobilized laccase from Coriolopsis gallica into Ca-alginate beads.Int Biodeterior
Biodegrad90: 71-78
21. Dhakar Kusum, Jain Rahul, Tamta Sushma ,Pandey Anita (2014) Prolonged Laccase Production by a Cold and pH Tolerant Strain of Penicillium pinophilum (MCC 1049) Isolated from a Low Temperature EnvironmentEnzyme Researc 2004:6 pages. 22. Dhouib.A., Chakroun. H., Mechichi. T., Martinez. M.J, Sayadi. S(2010)Purification and characterization of a novel laccase from the ascomycete Trichoderma atrovirideApplication on bioremediation of phenolic compounds.Process Biochemistry
45(4): 507-513.
23. Eggert C., Temp U., Eriksson K.E.L(1996) The ligninolytic system of the white rot fungus Pycnoporus cinnabarinus: Purification and characterization of the laccase. Appl. Environ. Microb62: 1151-1158.
24. Galai S., Limam F., Marzouki M.N (2009) A new Stenotrophomonas maltophilia
strain lroducing laccase use in decolorization of synthetics dyes.Appl Biochem Biotechnol 416-431.
25. Glenn J.K., Morgan M.A., Mayfield M.B., Kuwahara M., Gold M.H. (1983). An extracellular H2O2 requiring enzyme preparation involved in lignin biodegradation by the white rot basidiomycete Phanerochaete chrysosporium. Biochem. Biophys. Res. Commun114(3):1077-1083.
26. Givaudan A., Effosse A., Faure D., Potier P., Bouillant M.L., Bally R (1993) Polyphenol oxidase in Azospirillum lipoferum isolated from rice rhizosphere: evidence for laccase activity in nonmotile strains of Azospirillum lipoferum. FEMS Microbiol Lett 108:205–210.
27. Hadibarata T., Yusoff A.R.M., Kristanti R.A (2012) Decolorization and meabolism of Anthraquionone-type dye by laccase of white-rot fungi Polporus sp. S133. Water
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền
Air Solid Pollut233: 933-941.
28. Haki G.D., Rakshit S.K (2003) Developments in industrially important thermostable enzymes: a review. Bioresour. Technol 89: 17-34.
29. Heinfling A., Bergbauer M., Szewzyk U (1997) Biodegradation of azo and phthalocyanine dyes by Trametes versicolor and Bjerkandera adusta. Appl. Microbiol. Biotechnol48(2): 261-266.
30. Hou H., Zhou J., Wang J., Du C., Yan B (2004) Enhancement of laccase production by Pleurotus ostreatus and its use for the decolorization of anthraquinone dye. Pro. Biochem39(11): 1415-1419.
31. Hu D.D., Zhang R.Y., Zhang G.Q., Wang H.X., Ng T.B (2011) A laccase with antiproliferative activity against tumor cells from an edible mushroom, white common
Agrocybe cylindracea. Phytomedi 18: 374-379.
32. Husseiny Sh.M (2008) Biodegradation of the Reactive and Direct Dyes Using Egyptian Isolates.J Appl Sci Res 4(6): 599- 606.
33. Jaouani A., Guillen F., Penninckx M.J., Martinez A., Martinez M.J (2005) Role of
Pycnoporus coccineus laccase in the degradation of aromatic compounds in olive oil mill wastewater, Enzyme Microb Technol 36:478–486.
34. Jegatheesan M., Eyini M (2014)Response Surface Methodology Mediated Modulation of LaccaseProduction byPolyporus arcularius. Arab J Sci Eng.
35. Jones C.L., Baker W.L., lonergan G.T (2001)Dimethylsulfoxide elevates extracellular laccase (phenol oxidase) activity of Pycnoporus cinnabarinus grown on a low nutritional newspaper medium.J Chem Technol Biotechnol 76:494–500.
36. Joshi M., Bansal R., Purwar R (2004) Color removal from textile effluents.Indian J. Fiber Textile Res 29: 239-259.
37. Kalpana D., Velmurugan N., Shim J.H., Oh B.T., Senthil K., Lee Y.S (2012) Biodecolorization and biodegradation of reactive Levafix Blue E-RA granulate dye by the white rot fungus Irpex lacteus.J. Environ. Manage 111:142-149.
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền
38. Kalyani D., Dhiman S.S., Kim H., et al (2012) Characterization of a novel laccase from the isolated Coltricia perennis and its application to detoxification of biomass.
Process Biochem.
39. Kapdan I. K., Kargi F (2002) Biological decolorization of textiledyestuff containing wastewater by Coriolus versicolor in a rotating biological contactor.
Enzyme Microb. Technol30: 195-199.
40. Knapp J.S., Vantoch-Wood E.J., Zhang F (2001) Use of wood – rotting fungi for the decolorization of dyes and industrial effluents. In: Fungi in Bioremediation. G. M. Gadd(Ed.). Cambridge University Press, Cambridge 253-261.
41. Knapp J.S., Newby P.S., Reece, L.P (1995) Decolorization of dyes by wood rotting
Basidiomycete fungi.Enzyme Microbial. Biotechnol 17: 664–668.
42. Kiiskinen L.L., Ratto M., Kruus K (2004) Screening for novel laccase-producing