Các màu RBBR, NY5 thuộc nhóm màu Anthraquinone được sử dụng trong nghiên khả năng loại màu bằng laccase thô của chủng FBD154 và hiệu suất loại màu được thể hiện trong hình 3.13.
(A) (B)
Hình 3.13. Khả năng loại màu thuốc nhuộm RBBR (A); NY5 (B) của dịch enzyme thô của chủng Polyporus sp. FBD154 khi có và không có mặt các chất gắn kết
Hình 3.14. Sự thay đổi màu RBBR bởi laccase thô từ chủng Polyporus sp.FBD154 khi có và không có mặt các chất gắn kết
Hình 3.15. Sự thay đổi màu NY5 bởi laccase thô từ chủng Polyporus sp.FBD154 khi có và không có mặt các chất gắn kết
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền
Laccase thô thu được từ chủng nấm Polyporussp.FBD154 có khả năng loại màu RBBR cao. Khi không sử dụng chất gắn kết sau 5 phút chỉ có thể loại được 15 % nhưng sau 30 phút thì khả năng loại màu đã đạt tới 82,5 % . Trong khi đó với các thí nghiệm bổ sung thêm chất gắn kết là Ace và Sy khả năng loại màu cho kết quả tương đối cao lần lượt là 68 và 74 % sau 5 phút. Sau 30 phút hiệu suất loại màu ở tất cả các thí nghiệm có mặt CGK đều xác định được 68-91 % (Hình 3.13A).
Với màu NY5 khả năng loại màu tương đối đồng đều. Ở thí nghiệm không bổ sung CGK sau 5 phút chỉ có khả năng loại được 20 %. Nhưng sau 1 h hiệu suất loại màu đã tăng lên rõ rệt đến 24 hđã đạt giá trị cực đại là 75 %. Bên cạnh đó với những thí nghiệm có CGK thì khả năng loại màu lần lượt là VIO 80 %, HBT 80 %, Si 73 %, Sy 65 % và Ace 61 % sau 24h theo dõi. Như vậy, với màu NY5 khi bổ sung thêm CGK là VIO và HBT đã làm tăng hiệu quả loại màu nhưng khi bổ sung các CGK còn lại thì khả năng loại màu không tăng mà thậm chí còn giảm so với mẫu đối chứng (Hình 3.13B).
Chủng nấm P. pseudobetulinus có khả năng loại 65% màu Ambifix Blue H3R sau 15 phút và 80% màu Malachite Green sau 24 h [20]. Theo Hou và đồng tác giả laccase thô nuôi cấy từ chủng Pleurotus ostreatus 32 (30.000 U/l) loại được 66% màu Anthraquinone SN4R. Khi có mặt ATBS (0,16%) hiệu suất loại màu của dịch enzyme tăng lên 90% [30]. Chủng nấm trắng Trametes sp. SQ01 phân hủy 97-99% thuốc nhuộm azo và RBBR trong vòng 7 ngày nuôi cấy.Laccase tinh sạch từ chủng Trametes
sp. SQ01 (hoạt tính ban đầu 500 U/l) có khả năng loại bỏ tới 80% RBBR trong khoảng nồng độ 50-400 ppm trong 30 phút ở pH 4,5; tại nồng độ 1000 ppm 30% RBBR bị loại bỏ trong 30 phút [24]. Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu khác lại cho thấy khả năng loại màu tốt của dịch enzyme ngay cả trong trường hợp không có chất gắn kết. Laccase từ loài Pycnoporus sanguineus loại màu thuốc nhuộm anthraquinone RBBR đạt 60% sau 24h ở 32ºC mà không sử dụng chất gắn kết [83]. Soares và cộng sự đã cho thấy hơn 90% màu RBBR bị loại trong 20 phút khi sử dụng 5,7 mM VIO [88].
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền 3.5.2. Khả năng loại màu azo (NY1, NY7) bởi laccase thô từ chủng Polyporus sp. FBD154
Các màu thuốc nhuộm hoạt tính NY1, NY7 thuộc nhóm màu Azo, có cấu trúc bền nhất và được sử dụng nhiều trong các ngành công nghiệp nhuộm nhưng lại rất khó bị phân hủy. Vì vậy thí nghiệm sử dụng laccase thô từ chủng FBB154 để loại màu azo được khảo sát.
(A) (B) Hình 3.16. Khả năng loại màu thuốc nhuộm NY1 (A); NY7 (B) của enzyme thô của chủng
Polyporus sp. FBD154 khi có và không có mặt các chất gắn kết
Hình 3.17. Sự thay đổi màu NY1 bởi laccase thô từ chủng Polyporus sp. FBD154 khi có và không có mặt các chất gắn kết
Hình 3.18. Sự thay đổi màu NY7 bởi laccase thô từ chủng Polyporus sp. FBD154 khi có và không có mặt các chất gắn kết
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền
(trừ CGK là Si đạt 19 %) riêng với thí nghiệm không bổ sung thêm CGK hiệu suất loại màu đạt 57 %. Riêng với 2 CGK là Ace và Sy hiệu suất loại màu đã thu được cực đại sau 5 phút với hiệu suất lần lượt là 87 và 85 %. Hiệu suất loại màu ở thí nghiệm không có CGK và các thí nghiệm có chứa CGK là Si, ViO, HBT lần lượt đạt 72 %, 78 %, 89 %, 89 % sau 24h.
Khác với màu NY1 enzyme thô của chủng Polyporus sp. FBD154 có hiệu suất loại màu NY7 khác hẳn. Cụ thể sau là 5 phút với các chất gắn kết khác nhau hiệu suất loại màu là: 23 % VIO, 18 % HBT,92 % Ace, 92 % Sy. Sau 24 h hiệu suất loại màu thu được từ 84 đến 92% khi có mặt tất cả các chất gắn kết. Riêng thí nghiệm không có chất gắn kết hiệu suất loại màu thuốc nhuộm này thu được chỉ 46 % sau 24 h. Trong trường hợp này CGK đã làm tăng khả năng xúc táccủa laccase lên rất nhiều.
Theo Martinez và đtg, laccase thô của chủng Pycnoporus sanguineus CS2 có khả năng loại 70% màu MR (methyl red) mà không sử dụng chất gắn kết. Couto và cộng sự [17] cũng đã công bố rằng laccase từ Trametes hirsute loại khoảng 90% màu axit đỏ 97 chỉ trong 3 phút khi có mặt của 2 mM và 5 mM VIO.
3.5.3. Khả năng loại màu thương mại (CLS và LF-2B) bởi laccase thô của chủng Polyporus sp.FBD154 Polyporus sp.FBD154
(A) (B) Hình 3.19. Khả năng loại màu thuốc nhuộm CLS (A); LF-2B (B) của dịch enzyme thô của
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền
Hình 3.20. Sự thay đổi màu CLS bởi laccase thô từ chủng Polyporus sp. FBD154 khi có và không có mặt các chất gắn kết
Hình 3.21. Sự thay đổi màu LF-2B bởi laccase thô từ chủng Polyporus sp. FBD154 khi có và không có mặt các chất gắn kết
Khi không bổ sung CGK hiệu suất loại màu CLS tương đối cao 53% sau 3 h và 62% sau 24 h. Laccase thô từ chủng nấm FBD154 khi kết hợp với chất gắn kết có khả năng loại được màu CLS với hiệu suất khá cao đạt từ 56 % đến 87 % sau 24 h. Cũng giống như các màu khác khi có mặt của 2 CGK là Ace và Sy hiệu suất loại màu tăng lên rõ rệt. Sau 5 phút với chất gắn kết là Ace và Sy đã loại được lần lượt là 72 % và 73 % các giờ tiếp theo kết quả này thay đổi không đáng kể.
Với màu LF-2B khi không có mặt của CGK thì hiệu suất loại màu chỉ đạt 18% sau 3h nhưng sau 24 h hiệu suất loại màu thuốc nhuộm này đã là 73%. So với màu CLS thì màu LF-2B có hiệu suất loại màu cao hơn khi sử dụng 2 CGK là Ace và Sy. Sau 5 phút cả 2 CGK này đều loại được 90% màu thương mại LF-2B. Ở các thí nghiệm khác hiệu suất loại không cao sau 5 phút nhưng sau 24 h thì hiệu quả loại màu đã tăng lên rõ rệt và thu được từ 73 đến 94% (Hình 3.21).
Cui và cộng sự cũng đã thông báo laccase từ loài nấm Coriolopsis polyzona có khả năng loại được 73,8% màu acid blue 62; 29,9% màu acid black 194; 55,3% màu reactive black và 44,6% màu direct blue 71 với sự có mặt của 2,5 mM VIO (Cui et al., 2009). Laccase từ Trametes versicolor có tốc độ loại màu thấp (5,67%) với màu
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền
reactive black 5 khi có mặt của HBT ở tỷ lệ màu/ chất gắn kết 1:5, trong khi chỉ một mình laccase không thể loại được [10]. Husseiny (2008) cũng thông báo rằng hai loài nấm sợi Aspergillus niger và Penicillium spp. có khả năng khử màu reactive dye (lần lượt là 74,2% và 77,87%) và direct dye (78,3%; 67,42%) nhưng không đề cập tới khả năng sinh enzyme [32]. Ngoài ra, Khelifi và cộng sự đã chứng minh được chủng
Aspergillus alliaceus 121C loại lần lượt 98,6 và 98% màu Indigo và Congo đỏ sau 9 ngày nuôi và hoạt tính laccase tạo ra 79 U/l [44].
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền
Bảng 3.3. Hiệu suất loại màu của thuốc nhuộm hoạt tính bằng laccase của FBD154 khi có mặt các chất gắn kết khác nhau
Màu Enzyme và CGK
Thời gian Hoạt tính laccase
(U/l) 5 m 30 m 1 h 2 h 3 h 24 h 0 h 24 h RBBR E 15 83 88 93 93 96 1000 677 E + Ace 68 70 71 74 74 82 1000 618 E + Si 5 68 78 82 82 89 1000 784 E + VIO 17 90 91 95 93 96 1000 641 E + HBT 20 91 94 97 95 98 1000 687 E + Sy 74 76 75 77 78 84 1000 729 NY5 E 20 52 59 66 68 75 1000 582 E + Ace 27 44 47 50 52 61 1000 583 E + Si 1 26 40 52 59 73 1000 625 E + VIO 19 60 67 73 74 80 1000 591 E + HBT 17.5 50 61 71 74 80 1000 611 E + Sy 36 54 55 57 59 65 1000 611 NY1 E 57 60 59 60 65 72 1000 883 E + Ace 87 87 86 85 86 89 1000 759 E + Si 19 46 52 54 63 78 1000 910 E + VIO 62 76 82 84 87 89 1000 805 E + HBT 62 75 79 81 84 89 1000 899 E + Sy 85 85 84 84 86 88 1000 578 NY7 E 17 17 18 18 19 46 1000 718 E + Ace 92 90 90 89 88 89 1000 781 E + Si 0 33 56 57 64 83 1000 883 E + VIO 23 48 77 84 88 91 1000 767 E + HBT 18 28 43 60 80 91 1000 745 E + Sy 92 91 92 91 91 92 1000 763 CLS E 3 6 6 53 53 62 1000 724 E + Ace 72 72 73 73 73 77 1000 689 E + Si 1 1 8 27 37 55 1000 770 E + VIO 4 26 52 75 77 87 1000 728 E + HBT 3 14 33 66 69 79 1000 686 E + Sy 73 74 75 75 75 78 1000 679 LF-2B E 1 4 6 13 18 73 1000 922 E + Ace 90 90 90 90 90 90 1000 931 E + Si 0 0 13 62 70 88 1000 921 E + VIO 1 22 36 76 79 85 1000 250 E + HBT 0 18 37 92 92 94 1000 950 E + Sy 91 91 91 91 91 92 1000 797
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền
Bảng 3.4. So sánh hiệu suất loại màu bởi laccase của chủng nấm FBD154 so với laccase thu được của các chủng nấm khác
Laccase Nồng
độ màu
Hiệu suất loại màu Tài liệu tham khảo
Polyporus pseudobetulinus
200 ppm
65% màu Ambifix Blue H3R sau 15 phút và 80% màu Malachite Green sau 24 h.
Songserm et al., 2012 [89] Coriolopsis polyzona 100 ppm
73,8% màu acid blue 62; 29,9% màu acid black 194; 55,3% màu reactive black và 44,6% màu direct blue 71 khi sử dụng laccase có bổ sung 2,5 mM VIO
Cui et al., 2009 [18]
Pycnoporus
sanguineus CS2 25 μM 70% màu Methyl Red và 15% màu Reactive Black 5 sau 4 giờ ở 25ºC Martínez et al., 2013[51] Pycnoporus coccineus BRFM 938 40 ppm 26% Poly R-478, 93% RBBR, 100% Bromocresol purple, 92% Reactive black 5, 100% Acid yellow 17 sau 52 giờ khi bổ sung HBT
Uzan et al., 2010 [95] Trametes versicolor 100 ppm
91,5% Reactive Blue KN-R ở 40oC sau 16 giờ; 68,9% Acid Red 35 ở 50oC sau 24 giờ; 59,7% DirectTurquoise Blue 5B và 68,2% Direct Orange 7 sau 28 giờ ở 40o C Li et al., 2014[47] Lentinus Polychrous 40 ppm
85% Acid Blue 80; 30% Water Blue; 20% Indigo Carmine; ít hơn 10% đối với các màu thuộc nhóm azo (Reactive Black 5, Reactive Orange 16, Reactive Green 19) sau 120 phút. Ratanapongleka, Phetsom, 2014 [71] Funalia trogii 100 ppm
74,96% Reactive Black 171; 78,14 Reactive Black 5 sau 5 phút ở 30o C Yeşİlada et al., 2014[104. Trichoderma sp. FCP3 100 ppm
92% Acid bue 62; 86% Remazol brilliant bue R; 64% Acid blue 281; 60% Acid red 299; 6% Acid red 266 sau 3 giờ Hoang Thị Nhung et al., 2011[4] Trametes sp. SQ01 1000
ppm 30% Remazol brilliant bue R bị loại bỏ trong 30 phút
Xiao et al., 2013 [101] Polyporus sp.FBD154 100 ppm
90% màu Remazol brilliant bue R với CGK là VIO sau 30 phút; 80% màu Acid blue 281 khi có mặt CGK là HBT sau 24 h; 87% màu Acid red 299 với CGK là Ace sau 5 phút; 92% màu Acid red 266, 91% màu Evezol Red và 73% màu Megafix black CLS với CGK là Sy sau 5 phút với nồng độ CGK là 200 µM
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
1. Từ 60 chủng nấm đảm thu thập ở vườn Quốc gia Bidoup- Núi Bà thuộc tỉnh Lâm Đồng đã phân lập được 38 chủng và lựa chọn được chủng FBD154 có khả năng sinh tổng hợp laccase trên môi trường TSH1 có hoạt tính ban đầu cao nhất là 4233 U/l;
2. Chủng FBD154 thuộc lớp nấm đảm Basidiomycetes, chi Polyporusvà được đặt tên là Polyporus sp. FBD154 với mã số đăng ký trên Genbank là KR 920049; 3. Polyporus sp. FBD154 có khả năng sinh tổng hợp laccase cao thời gian nuôi cấy
ngắn ở pH thấp với hoạt tính 74.925 U/l sau 4 ngàytrên môi trường chứa dịch chiết khoai tây 200g/l, casein 1 g/l, cám gạo 1 g/l, bột đậu tương 5 g/l, mannose 10 g/l, CuSO4 0,3 mM, 3 g/l NH4Cl, pH 4 và tốc độ lắc 200 v/phút, ở 30oC; 4. Khi có mặt của 200 µM CGK dịch enzyme thô của chủng đã loại được 90%
màu RBBR ; 80% màu NY5; 87% màu NY1; 92% màu NY7, 91% màu LF-2B và 73% màu CLS . Sau 30 phút hiệu suất loại màu của RBBR, NY1, NY5 lần lượt là 83%, 60%, 52% khi không có mặt CGK;
5. Chủng nấm đảm được phân lập từvườn Quốc gia Bidoup- Núi Bà thuộc tỉnh Lâm Đồng với các đặc tính của laccase khác hẳn so với các công bố quốc tế có mức tương đồng tới 99% với P. arcularius DSH92132, chủng nấm đảm này có tiềm năng cao trong xử lý ô nhiễm môi trường và loại màu thuốc nhuộm. Với các kết quả thu được chủng nấm đảm này đã được chấp nhận đơn đăng ký quyền sở hữ trí tuệ.
Kiến nghị
1. Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp các enzyme ngoại bào khác của chủng FBD154 như chitinase, protease, xylanse v.v.
2. Nghiên cứu một số điều kiện nuôi cấy khác để tiếp tục nâng cao hoạt tính sinh tổng hợp laccase của chủng Polyporus sp. FBD154. Xác định cấu trúc của
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền
laccase do FBD154 tạo ra sau khi đã được làm sạch và nghiên cứu các đặc tính cơ bản của loại enzyme này.
3. Đánh giá khả năng phân hủy dioxin, PCB, PAH và phenol bởi chủng Polyporus
sp. FBD154.
4. Đánh giá khả năng kháng các VSV gây bệnh, sinh tổng hợp các chất kháng nấm của chủng Polyporus sp. FBD154.
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Đào Thị Ngọc Ánh, Đặng Thị Cẩm Hà (2009) Khả năng phân hủy DDT của chủng nấm sợi FNA1 phân lập từ đất nhiễm hỗn hợp thuốc trừ sâu tại Nghệ An. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Thái Nguyên 57(9): 46-51.
2. Đặng Thị Cẩm Hà (2012) Nghiên cứu công nghệ sản xuất enzyme ngoại bào Laccase, Manganese Peroxidase (MnP), Lignin Peroxidase (LiP) từ vi sinh vật phục vụ xử lý các chất ô nhiễm đa vòng thơm. Đề tài độc lập cấp nhà nước176-178.
3. Đặng Thị Thu, Tô Kim Anh, Lê Quang Hòa, Lê Hồng Nga (2009) Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn nấm sợi sinh tổng hợp laccase từ rừng tự nhiên Việt Nam. Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc 376-380.
4. Hoàng Thị Nhung, Đinh Thị Thu Hằng, Đặng Thị Cẩm Hà (2011) Sàng lọc chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp laccase và phân hủy các hợp chất đa vòng thơm, loại màu thuốc nhuộm. Tạp chí Công Nghệ Sinh học11 (2): 265-274
5. Nguyễn Nguyên Quang, Nguyễn Thị Lệ, Nguyễn Bá Hữu, Đặng Thị Cẩm Hà (2010) Phân hủy sinh học các hợp chất vòng thơm và thuốc nhuộm của chủng nấm sợi FBH11 phân lập từ đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại điểm nóng Biên Hòa. Hội nghị Khoa học Kỷ niệm 35 năm thành lập Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Hà Nội 2010: 392-