với các chủng đại diện tương đồng trên GenBank đã được tiến hành.
3.3.2.2. Phân loại bằng phương pháp xác định và so sánh trình tự vùng ITS (ITS1 - 5,8 S - ITS2) S - ITS2)
Trong nhiều công bố, các gene mã hóa rRNA 18S và 28S thường được sử dụng để xác định mối quan hệ phát sinh chủng loại của nấm. Tuy nhiên, các đoạn trình tự
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền
này chỉ phù hợp để xác định các bậc phân loại cao (chi, họ, bộ v.v.). Hiện nay, vùng ITS (Internal Transcribed Space) bao gồm ITS1 (nằm giữa gene 18S và 5,8S) và ITS2 (nằm giữa gene 5,8S và 28S) đã được sử dụng để phân loại và đánh giá sự đa dạng của nấm. Đặc biệt để định loại nấm đến loài người ta thường sử dụng đoạn trình tự ITS1 – 5,8S – ITS2. Hai vùng trình tự ITS1 và ITS2 được lựa chọn làm marker chuẩn cho mã vạch DNA (DNA barcode) của nấm do chúng dễ dàng được khuếch đại từ những lượng nhỏ DNA (vì số lượng bản copy cao) và có mức độ biến đổi cao giữa các loài có mối quan hệ gần gũi.
Sản phẩm PCR nhân vùng ITS nêu trên bởi cặp mồi ITS1 và ITS4 từ DNA của chủng FBD154 đã được giải trình tự với kích thước là 592 nucleotide. Cây phát sinh chủng loại của chủng nấm FBD154 được thể hiện ở hình 3.5.
Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trần Thị Thu Hiền
Trình tự vùng ITS của chủng nấm FBD154 có mức độ tương đồng 99% với các chủngPolyporus arcularius DSH92132 (mã số KP283489.1), Polyporus arcularius
JZB2115031 (JQ283966.1). Tương đồng 98% với chủng Polyporus arcularius MI51 (mã số KC581792.1) và tương đồng xa hơn (92%) so với chủng polyporus tricholoma
CulTENN9579 SBI (AF516554.1). Trong các chủng nấm đảm, chi Polyporus không chỉ có tiềm năng sinh tổng hợp laccase mà các đại diện của chi này còn có khả năng sinh các enzyme khác như: lignin peroxidase, manganese peroxidase, chitinase, xylanase v.v. Đồng thời, nhiều loài trong chi Polyporus cũng có khả năng chuyển hóa hay phân hủy nhiều hợp chất độc hại khác như thuốc nhuộm và các hợp chất PAH (polycyclic aromatic hydrocarbon). Nấm Polyporus arcularius MI51 được phân lập từ Tamil Nadu Ấn Độ có khả năng sinh tổng hợp laccase ở mức trung bình với hoạt tính là 9.300 U/l sau 21 ngày nuôi cấy trên môi trường muối khoáng cơ bản [34]. Ngoài ra
Polyporus arcularius T438 có khả năng sinh tổng hợp laccase với hoạt tính 2.700 U/l trên môi trường MVM - modified Vogel medium [6] sau 15 ngày nuôi cấy.
Kết quả phân loại dựa trên hình thái và xác định trình tự vùng ITS thì chủng này thuộc lớp nấm đảm Basidiomycetes, chi Polyporus và được đặt tên là Polyporus sp. FBD154 và được đăng ký trên GenBank với mã số KR 920049.