Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.1. Nội dung nghiên cứu
3.1.1 Điều tra khả năng sinh sản của đàn lợn nái ngoại qua các lứa: 1; 2 – 4; > 4. 4; > 4.
3.1.2. Khảo sát tỷ lệ mắc hội chứng M.M.A ở đàn lợn nái sau khi sinh. 3.1.3. Xác định một số chỉ tiêu lâm sàng của lơn nái mắc hội chứng M.M.A 3.1.3. Xác định một số chỉ tiêu lâm sàng của lơn nái mắc hội chứng M.M.A 3.1.4 Xác định ảnh hưởng của hội chứng M.M.A đến năng suất sinh sản 3.1.5 Xác định thành phần các loại vi khuẩn trong dịch tiết tử cung của lợn nái tại trại lợn.
3.1.6 Xác định độ mẫn cảm của các loại vi khuẩn phân lập từ dịch viêm tử cung, âm đạo của lợn nái với thuốc kháng sinh cung, âm đạo của lợn nái với thuốc kháng sinh
3.1.7 Xác định độ mẫn cảm của tập đoànvi khuẩn phân lập được từ dịch viêm tử cung, âm đạo của lợn nái với thuốc kháng sinh viêm tử cung, âm đạo của lợn nái với thuốc kháng sinh
3.1.8 Thử nghiệm điều trị hội chứng M.M.A và theo dõi khả năng sinh sản sau khi khỏi bệnh của lợn nái sau khi khỏi bệnh của lợn nái
3.1.9 Thử nghiệm phòng hội chứng M.M.A cho lợn nái ngoại sản 3.2. ĐỐI TƯỢNG VÀ NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU 3.2. ĐỐI TƯỢNG VÀ NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU
3.2.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu của đề tài là đàn lợn nái ngoại sinh sản nuôi tại trại lợn giống Huyện Bình Lục - Hà Nam.
3.2.2. Nguyên liệu nghiên cứu
3.2.2.1. Các môi trường nuôi cấy và phân lập vi khuẩn * Các môi trường phổ thông
- Môi trường nước thịt: dùng để nuôi cấy mẫu xét nghiệm ngay từ đầu. - Môi trường thạch thường: dùng để kiểm tra khuẩn lạc và làm kháng sinh đồ.
*Các môi trường chuyên dụng dùng trong phân lập và giám định vi khuẩn
- Môi trường Sapman: dùng để phân lập và xác định độc lực của cầu khuẩn.
- Môi trường Brilliant Green agar: dùng để phân lập vi khuẩn E. Coli và
- Môi trường Edwards medium: dùng để phân lập vi khuẩn Streptococcus. - Môi trường thạch máu: dùng để giữ và bảo quản vi khuẩn.
3.2.2.2. Giấy tẩm kháng sinh
- Các mảnh giấy chuẩn đã được tẩm kháng sinh theo đúng tiêu chuẩn Quốc tế do hãng Oxoid (Phạm Hữu Doanh) sản xuất.
- Các thuốc kháng sinh dùng để tẩm đều đạt tiêu chuẩn dược điển Việt Nam 1994 do phòng quản lý thuốc thú y - Cục thú y Trung ương cung cấp.
Địa điểm nghiên cứu: phòng thí nghiệm trọng điểm 3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
+ Xác định tỷ lệ lợn nái mắc bệnh Viêm tử cung bằng phương pháp điều tra, phỏng vấn trực tiếp công nhân làm tại trại, kết hợp với theo dõi trực tiếp.
+ Phân lập giám định thành phần, vi khuẩn trên các môi trường chuyên dụng theo các phương pháp vi sinh vật thường quy.
+ Thực hiện kỹ thuật kháng sinh đồ theo phương pháp Kirby - Bauer. Kháng sinh tẩm vào đĩa giấy với nồng độ thích hợp sẽ khuếch tán ra mặt thạch xung quanh và ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn. Đường kính vòng vô khuẩn bị ức chế thể hiện tính nhạy cảm của vi khuẩn đối với thuốc kháng sinh. Trường hợp không có vòng ức chế có nghĩa là vi khuẩn kháng lại thuốc kháng sinh. Các
vi khuẩn được xác định nuôi cấy là Staphylococcus, Streptococcus, E. Coli và
Salmonella.
+ Xác định phác đồ điều trị bệnh hữu hiệu qua theo dõi khả năng sinh sản của những lợn nái sau khi được điều trị lành bệnh.
3.3.1. Lấy mẫu dịch tử cung của lợn nái
* Cách lấy mẫu dịch tử cung lợn để xét nghiệm
Thực hiện lấy mẫu dịch tử cung của lợn nái bình thường sau đẻ 12 -24 giờ và lợn nái bị viêm tử cung ở các trại được điều tra.
Dùng mỏ vịt (đã được sát trùng) để mở mở âm đạo, sau đó lấy thìa sản khoa thu dịch tử cung cho vào ống nghiệm (đã được vô trùng), mỗi lần lấy khoảng 3- 5 ml.
* Bảo quản và xử lý mẫu
Các mẫu dịch thí nghiệm sau khi lấy đựơc bảo quản lạnh bằng thùng đá
trong quá trình vận chuyển và bảo quản ở -200C tại phòng thí nghiệm cho đến khi
3.3.2. Phương pháp xác định số loại và số lượng vi khuẩn
3.3.2.1. Phương pháp xác định số loại vi khuẩn
Mỗi loại vi khuẩn khi mọc trên các môi trường thì khuẩn lạc có đặc tính mọc đặc trưng. Dựa vào những đặc điểm đặc trưng đó để xác định loại vi khuẩn có trong mẫu dịch tử cung.
- Môi trường thạch thường:
+ Staphylococcus: khuẩn lạc dạng S, tròn bóng, rìa gọn, mặt lồi, có màu vàng. + Streptococcus: khuẩn lạc dạng S, nhỏ, màu hơi xám, bóng.
+ Salmonella: khuẩn lạc dạng S, có thể dạng R, tròn, trong hoặc hơi xám, nhẵn bóng, hơi lồi lên ở giữa.
+E. Coli: khuẩn lạc dạng S, có thể dạng R, tròn, ướt, màu tro hay trắng
nhạt, hơi lồi.
- Môi trường thạch MacConkey:
+ E. Coli: hình thành những khuẩn lạc dạng S, màu hồng cánh sen.
+ Salmonella: khuẩn lạc tròn, trong không màu, nhẵn bóng, hơi lồi ở giữa. - Môi trường thạch Birrilliant Green Agar:
+ E. Coli: khuẩn lạc dạng S, màu vàng chanh. + Salmonella: khuẩn lạc dạng S, màu hồng nhạt.
- Môi trường Chapman:
+ Staphylococcus: khuẩn lạc to, rìa gọn, nếu là tụ cầu gây bệnh làm môi
trường biến màu vàng, nếu là tụ cầu không gây bệnh: môi trường màu đỏ. - Môi trường Edwards Medium:
+ Streptococcus: vi khuẩn mọc tốt, khuẩn lạc nhỏ, mịn, ướt, mặt hơi lồi, trong sáng.
Trên cơ sở đó sau khi nuôi cấy mẫu trên môi trường thạch thường trong tủ
ấm 37oC/18- 24 giờ, quan sát hình thái và kích thước khuẩn lạc ta có thể phân
loại và xác định được số lượng của từng loại. Sau đó tiến hành phân lập, giám định các khuẩn lạc đó bằng cách chọn các khuẩn lạc điển hình cho từng loại vi khuẩn cấy sang các môi trường chuyên dụng.
3.3.2.2. Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn
trên môi trường thạch thường, tuỳ theo số vi khuẩn có trong bệnh phẩm. Mẫu xét nghiệm cần phải pha loãng đến mức độ cần thiết. Sau nhiều lần cấy mẫu với các độ pha loãng khác nhau, chúng tôi đã xác định đựơc độ pha loãng thích hợp với các bệnh phẩm như sau:
+ Dịch tử cung lợn sau đẻ là: 10-4.
+ Dịch tử cung lợn bị viêm tử cung là: 10-7.
- Sau khi pha loãng, chúng tôi tiến hành cấy vi khuẩn vào đĩa thạch. Cấy dịch pha loãng mẫu trong môi trường thạch cứng rồi đếm số lượng khuẩn lạc (CFU). Số lượng CFU tương đương với số lượng vi khuẩn. Để có kết quả chính xác, cần thống nhất nhiệt độ và thời gian nuôi cấy. Số vi khuẩn có trong 1 ml dịch mẫu được tính theo công thức:
X= 10.A/N
Trong đó: X: số khuẩn lạc trong 1ml dịch.
A: số khuẩn lạc trung bình trên một đĩa petri.
N: độ pha loãng.
3.3.3. Xác định độ mẫn cảm của các chủng vi khuẩn và tập đoàn vi khuẩn phân lập được từ dịch tử cung lợn với thuốc kháng sinh. phân lập được từ dịch tử cung lợn với thuốc kháng sinh.
- Dùng tampon vô khuẩn nhúng vào nhuyễn dịch rồi lấy lên ép nhẹ và xoay nhẹ que gòn trên thành ống nghiệm. Động tác này sẽ loại bỏ được lượng huyễn dịch vi khuẩn thừa khỏi que gòn.
- Ria vi khuẩn lên mặt thạch. Chờ thạch khô trong vòng 3 - 5 phút.
- Dùng pank vô trùng đặt các mảnh giấy kháng sinh tiếp xúc đều với mặt thạch. Các mảnh giấy tẩm kháng sinh đặt cách nhau không dưới 24 mm. Sau khi đặt các mảnh giấy vào đĩa thạch được khoảng 15 phút, đặt đĩa thạch vào tủ ấm
37oC, sau 16 - 18 giờ lấy ra đọc kết quả.
- Sau khi ủ 16 - 18 giờ, vi khuẩn sẽ mọc thành những khóm mịn tiếp hợp nhau và vòng vô khuẩn là một vòng tròn đồng nhất.
- Đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước có đơn vị là mm, bằng cách áp thước lên mặt sau của đáy hộp thạch. Nếu cạnh của vòng ức chế không rõ nét thì phải đo chỗ hẹp nhất và chỗ rộng nhất rồi lấy giá trị trung bình. Đường kính của vòng vô khuẩn đựơc tính ra mm. Nếu khuẩn lạc mọc trong vòng ức chế rõ ràng thì phải nuôi cấy, phân lập và thử lại.
- Đánh giá kết quả dựa theo theo tiêu chuẩn của Hội đồng Quốc gia Hoa Kỳ (1999).
Bảng 3.1. Bảng đánh giá đường kính vòng vô khuẩn theo tiêu chuẩn của Hội đồng Quốc gia Hoa Kỳ (1999)
Tên kháng sinh
Kháng sinh trong 1 mảnh
giấy (g)
Đường kính vòng vô khuẩn Kháng thuốc (mm) Mẫn cảm TB (mm) Rất mẫn cảm (mm) Enrofloxacin 20 16 17-22 23 Norfloxacin 10 12 13 - 17 17 Ciprofloxacin 15 13 15 - 20 23 Amoxycillin 20 13 14 - 16 17 Gentamicin 10 12 13 - 14 15 Ampicillin 10 11 12 - 13 14 Polymycin B 300IU 08 9 - 11 12 Ofloxacin 5 11 11 - 13 13 Penecillin 10UI 11 12-21 22
- Kết quả kháng sinh đồ được ứng dụng trong điều trị như sau:
+ Khi vi khuẩn ở mức rất mẫn cảm và mẫn cảm trung bình với thuốc, chúng ta sử dụng thuốc ở liều điều trị trung bình.
+ Khi vi khuẩn mẫn cảm yếu thì sử dụng thuốc điều trị ở liều tối đa của từng loại thuốc, hoặc bơm thẳng vào vị trí đang bị bệnh trong cơ thể.
+ Vi khuẩn kháng thuốc tuyệt đối không dùng thuốc bị kháng để điều trị bệnh.
3.4. Thử nghiệm phòng và điều trị hội chứng M.M.A 3.4.1 Phòng hội chứng M.M.A 3.4.1 Phòng hội chứng M.M.A
* Vệ sinh
- Vệ sinh chuồng đẻ, lợn nái, đặc biệt là bộ phận sinh dục trước và sau đẻ sạch sẽ là khâu rất quan trọng. Dùng 10ml dung dịch RTD-iodin 10% pha với 2 lít nước định kỳ sát trùng chuồng trại 10 ngày 1 lần và 5 ngày trước khi nái đẻ, giữ chuồng trại lợn nái khô sạch. Tắm cho nái trước khi đẻ 1 ngày và sau khi đẻ lau rửa bộ phận sinh dục lợn nái bằng dung dịch sát trùng RTD-iodin.
- Đảm bảo vệ sinh nguồn nước uống và thức ăn. Cho nái uống đủ nước trong giai đoạn mang thai (khoảng 20lít/con/ngày). Hạn chế khẩu phần ăn cho
nái trước khi sinh, giảm chất đạm, tăng cường chất xơ.
- Đảm bảo thực hiện khâu đỡ đẻ đúng kỹ thuật. Tay người đỡ đẻ phải được sát trùng kỹ trước khi thao tác. Thực hiện tốt việc để lợn nái đẻ tự nhiên, không can thiệp bằng tay (trừ trường hợp đẻ khó).
* Phối giống
Khi phối giống trực tiếp cả con cái và con đực phải được vệ sinh kỹ cơ quan sinh dục. Khi phối giống cho lợn bằng phương pháp thụ tinh nhân tạo phải đảm bảo vệ sinh sạch sẽ trước khi phối, sát trùng kỹ dụng cụ dẫn tinh, khi dẫn tinh phải nhẹ nhàng đảm bảo đúng kỹ thuật, vì nếu khâu phối giống không tốt sẽ làm xây sát niêm mạc tử cung, đưa mầm bệnh vào trong tử cung, làm lây lan mầm bệnh từ con ốm sang con khoẻ.
* Dùng thuốc ngay sau khi đẻ
- Tiêm ngay một liều thuốc kháng sinh để phòng ngừa Viêm đường sinh dục. Chọn những loại kháng sinh không ảnh hưởng đến quá trình tiết sữa như:
Terramycin*/LA tiêm bắp 1ml/10kgP, tiêm 1 liều duy nhất;Vidan-T tiêm bắp
20ml/con/lần x 2lần/ngày; Tylan 50 hoặc Suanavil 5 tiêm 10cc/1con/ngày, liên tục trong 3 ngày... Trong thời gian tiêm kháng sinh, tiêm trợ lực, trợ sức bằng vitamin C, vitamin B1, vitamin B12, B. complex, Gluconat canx…kích thích lợn ăn khoẻ để tiết sữa cho lợn con.
- Tiêm 1 mũi Hanprost, liều 1,5ml/con để tạo ra các cơn co bóp nhẹ nhàng giống cơn co bóp sinh lý nhằm đẩy các chất bẩn ra ngoài. Đồng thời nó còn có tác dụng kích thích cơ tử cung nhanh chóng hồi phục và phá huỷ thể vàng. Vì vậy, hạn chế được viêm tử cung và thúc đẩy gia súc nhanh chóng động dục trở lại sau cai sữa.
3.4.2. Điều trị bệnh Viêm nội mạc tử cung
Sau khi có kết quả làm kháng sinh đồ, chúng tôi chọn ra ba loại kháng
sinh mà tập đoàn vi khuẩn mẫn cảm nhất để xây dựng các phác đồ điều trị.
*3 phác đồ điều trị .
- Phác đồ 1:
+ Dùng Amoxycillin: 1 ml/ 10 kg P, tiêm bắp, liệu trình 3-5 ngày (2 lần/ ngày).
+ Dùng Dexamethazol: 10 ml/con/ngày.
- Phác đồ 2:
+ Dùng Lincomycin: 1 ml/10 kg P, tiêm bắp ngày 2 lần, kết hợp thụt rửa
bằng dung dịch KMnO4 0,1 % với liều 2000 ml/lần/con/ngày, liệu trình 3- 5 ngày.
+ Dùng Oxytocin 6 ml/lần/ngày, liệu trình 3-5 ngày.
- Phác đồ 3:
+Dùng Hanprost: 1,5 -2 ml/con, chỉ dùng 1 lần trong suốt quá trình điều trị. +Dùng Amoxycillin: 1 ml/10kg P, tiêm bắp, liệu trình 3-5 ngày (2 lần/ ngày). + Dùng dung dịch Lugol 0,1 % thụt rửa với liều 1500 ml/con/ngày, liệu trình 3-5 ngày.
+ Dùng Oxytocin 6 ml/lần/ngày, liệu trình 3- 5 ngày.
Cả 3 phác đồ đều dùng thêm thuốc bổ, trợ sức, trợ lực, dịch truyền, hạ sốt...
3.5. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Tất cả các số liệu đều được theo dõi, ghi chép và xử lý bằng phương pháp thống kê sinh vật học thông qua phần mềm Excel trên máy vi tính.
Tổng số con mắc bệnh
+Tỷ lệ mắc bệnh (%) = x 100
Tổng số con theo dõi
Tổng số con động dục
+Tỷ lệ động dục lại (%) = x 100
Tổng số con đã khỏi bệnh
Tổng số con có thai khi phối lần đầu
+ Tỷ lệ có thai khi phối lần đầu (%) = x 100
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ ĐIỀU TRA KHẢ NĂNG SINH SẢN CỦA ĐÀN LỢN NÁI NGOẠI QUA CÁC LỨA: 1; 2 – 4; > 4 NGOẠI QUA CÁC LỨA: 1; 2 – 4; > 4
Bảng 4.1. Kết quả điều tra khả năng sinh sản của đàn lợn nái ngoại qua các lứa 1, 2 – 4, > 4
Lứa Chỉ tiêu theo dõi
1 (n = 50) 2- 4 (n = 95) > 4 (n = 47) Tỷ lệ thụ thai (%) 78,00 94,74 72,34
Số con sinh ra /lứa 8,76 1,5 12,33 1,15 11,76 1,24 Số con sống sau 24 h 6,95 1,5 11,87 1,25 10,33 1,47 Trọng lượng lợn con sinh ra 1,0 0,25 1,1 0,25 0,9 0,55 Trọng lượng lợn con cai sữa 5,47 0,15 6,67 0,17 5,75 0,25
Bảng 4.1 cho thấy: Tỷ lệ thụ thai ở lứa 1 là 78,00%, lứa 2 – 4 là 94,74 %,
lứa > 4 là 72,34. Số con sinh ra ở lứa 1 là 8,76 1,5, lứa 2 – 4 là 12,33 1,15,
lứa > 4 là 11,76 1,24. Số con sống sau 24 h/ lứa là 6,95 1,5, lứa 2 – 4 là
11,87 1,25, lứa > 4 là 10,33 1,47. Trọng lượng lợn con sinh ra ở lứa 1 là
1,0 0,25, lứa 2 – 4 là 1,1 0,25, lứa > 4 là 0,9 0,55.Trọng lượng lợn con
cai sữa lứa 1 là 5,47 0,15, lứa 2 – 4 là 6,67 0,17, lứa > 4 là 5,75 0,25.
Như vậy qua bảng 4.1 thì tỷ lệ thụ thai, số con sinh ra / lứa, số con sống sau 24 h / lứa, trọng lượng lợn con sinh ra, trọng lượng lợn con cai sữa ở lứa 2 – 4 là cao nhất. Khả năng sinh sản của lợn ở lứa 2 – 4 đạt kết quả tốt nhất. Vì ở lứa 2 – 4 thì gia súc thành thục cả về tính dục và thể vóc, gia súc đẻ lứa 2 – 4 thì cổ tử cung mở rộng hơn thuận lợi cho việc sinh đẻ.
4.2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT TỶ LỆ MẮC HỘI CHỨNG M.M.A TRÊN ĐÀN LỢN NÁI SAU KHI SINH ĐÀN LỢN NÁI SAU KHI SINH
Kết quả bảng 4.2 cho thấy: Tỷ lệ lợn nái mắc hội chứng M.M.A khá cao dao động trong khoảng 33,33% đến 51,42%. Trong số 116 nái mắc hội chứng