3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Thịt bò, lợn, gà bán ở 04 chợ tại thành phố Móng Cái - Quảng Ninh. - Chỉ tiêu vi sinh vật: E.coli, Salmonella, Staphylococcus aureu, trong thịt tươi sống thịt (bò, lợn, gà) bán ở 04 chợ tại thành phố Móng Cái - Quảng Ninh.
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu
Trong điều kiện cho phép, phạm vi đề tài chỉ đề cập đến các chỉ tiêu: Vi khuẩn E. coli, vi khuẩn Salmonella, vi khuẩn Staphylococcus aureu.
3.1.3. Địa điểm nghiên cứu.
- Gồm 04 chợ: Chợ Hải Đông, Chợ Hải Hòa, Chợ Ka Long, Chợ Trung Tâm Móng Cái.
- Phòng thí nghiệm Bộ môn Vệ sinh Thú Y – Viện Thú Y Quốc gia.
3.1.4. Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 09/2016 - 10/2017.
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.2.1. Điều tra, đánh giá thực trạng quản lý và điều kiện vệ sinh thú y tại các quầy kinh doanh thịt gia súc, gia cầm ở 04 chợ tại thành phố Móng Cái - quầy kinh doanh thịt gia súc, gia cầm ở 04 chợ tại thành phố Móng Cái - Quảng Ninh
3.2.2. Xác định một số vi khuẩn chỉ điểm E.coli, Salmonella, Staphylococcus aureus gây ô nhiễm trong thịt, bò, lợn, gà aureus gây ô nhiễm trong thịt, bò, lợn, gà
3.2.3. Đề xuất một số giải pháp quản lý về vệ sinh thú y, góp phần đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm vệ sinh an toàn thực phẩm
3.3. NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU 3.3.1. Mẫu xét nghiệm 3.3.1. Mẫu xét nghiệm
Qua kết quả trên phiếu điều tra tôi tiến hành lấy 90 mẫu thịt (bò, lợn, gà) đang bán ở 04 chợ, Chợ Hải Đông, Chợ Hải Hòa, Chợ Ka Long, Chợ Trung Tâm TP Móng Cái.
Kỹ thuật lấy mẫu theo Thông tư Số: 66/2009/TT-BNNPTNT ngày 13 tháng 10 năm 2009 “Ban hành quy chuẩn kỹ thuật quốc gia lĩnh vực thú y” trong đó có quy định chung của quy chuẩn kỹ thuật lấy mẫu.‘‘Quy định chung của quy chuẩn kỹ thuật quốc gia kỹ thuật lấy và bảo quản mẫu thịt từ các cơ sở giết mổ và kinh doanh thịt để kiểm tra vi sinh vật’’.
Thời điểm lấy mẫu: Vào buổi sáng từ (6 – 8 giờ sáng) và có biên bản ghi đầy đủ các thông tin trong biên bản lấy mẫu.
3.3.2. Vật liệu, dụng cụ lấy mẫu
- Túi đựng bằng chất dẻo vô trùng túi linon.
- Etanol 70%/ bông thấm nước có tẩm Etanol 70% đựng trong chai. - Dao, kéo vô trùng.
- Găng tay vô trùng.
- Thùng xốp bảo quản mẫu với túi đá lạnh.
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.4.1. Phương pháp điều tra. 3.4.1. Phương pháp điều tra.
- Lập phiếu điều tra, bảng biểu thu thập số liệu về thực trạng điều kiện vệ sinh thú y, tình hình quản lý của các cơ quan hữu quan đối với các cửa hàng, quầy kinh doanh thịt (bò, lợn, gà) tươi sống ở 04 chợ tại thành phố Móng Cái - Quảng Ninh.
- Để đánh giá thực trạng vệ sinh thú y tại các quầy kinh doanh thịt gia súc gia cầm tôi tiến hành điều tra 280 phiếu tại các hộ kinh doanh và 350 phiếu đối với cơ quan hữu quan các Sở ban ngành đại diện của địa phương.
- Lập phiếu điều tra đến từng hộ kinh doanh thịt gia súc, gia cầm đang bày bán ở một số chợ trên địa bàn thành phố.
Mẫu phiếu điều tra được thiết kế dựa trên TCVN 5452 - 91.
Điều tra theo phiếu điều tra mẫu (595 mẫu phiếu): Gồm 02 mẫu phiếu. + Mẫu phiếu 1: Điều tra thực trạng quản lý của các cơ quan hữu quan đối với các quầy,cửa hàng kinh doanh sản phẩm gia súc, gia cầm trên địa bàn Thành phố (350 mẫu phiếu).
+ Mẫu phiếu 2: Điều tra thực trạng điều kiện vệ sinh thú y tại các quầy, cửa hàng kinh doanh sản phẩm gia súc, gia cầm trên địa bàn Thành phố Móng Cái (280 mẫu phiếu).
3.4.2. Phương pháp lấy mẫu
Tiến hành chọn mẫu ngẫu nhiên thịt (bò, lợn, gà) đã pha lọc đang bán tại các bàn, quầy ở các chợ và các hộ kinh doanh thịt (bò, lợn, gà) lấy mẫu bằng cách cắt tại các mặt cắt khác nhau của miếng thịt, mỗi vị trí cắt khoảng 25g thịt (bò, lợn, gà) Gộp các miếng mô vừa cắt thành một mẫu, cho vào túi đựng mẫu vô trùng để đồng nhất mẫu.
Dụng cụ lấy mẫu, chứa mẫu phải sạch, vô trùng và không ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật của mẫu thịt.
Bảo quản: Mẫu được bảo quản ở 40C - 60C trong thùng xốp có đá khô đã được chuẩn bị trước.
Mẫu được vận chuyển bằng phương tiện chuyên dùng chuyển đến Phòng thí nghiệm Bộ môn Vệ sinh Thú Y - Viện Thú Y Quốc gia.
3.4.3. Phương pháp xét nghiệm
Áp dụng phương pháp kỹ thuật xét nghiệm theo quy trình tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN), tham khảo một số quy trình của nước ngoài. Các xét nghiệm được thực hiện trên cơ sở trang thiết bị của Phòng thí nghiệm của Bộ môn vi trùng - Viện Thú Y Quốc gia.
▪ Để xác định vi khuẩn trong thịt:
+ Phương pháp phát hiện và đếm số E. coli: TCVN 5155 : 1990.
+ Phương pháp phát hiện và đếm số Salmonella: TCVN 5153 : 1990. + Phương pháp phát hiện và đếm số Sta. aureus: TCVN 5156 : 1990. 3.4.3.1. Xác định và tính chỉ số E. coli: (Coliindex)
Sau nuôi cấy 24 – 48 giờ, từ các ống CLP dương tính môi trường chuyển màu từ hồng đỏ sang vàng, có sinh khí trong ống Duharm, cấy chuyển sang môi trường thạch Endo. Khuẩn lạc E. coli sinh ánh kim trên môi trường Endo sau khi nuôi cấy ở 420C/24 giờ.
Để xác định chính xác E. coli, từ khuẩn lạc có ánh kim, cấy chuyển khuẩn lạc sang môi trường thạch máu để tủ ấm 420C/24 giờ. Lấy khuẩn lạc mọc trên môi trường làm test oxydaza và chạy máy Vitek định danh vi khuẩn. Ghi chép các ống nghiệm dương tính, tra bảng MPN được số gần đúng trực khuẩn E. coli/1g mẫu xét nghiệm.
Trường hợp không dùng máy định danh vi khuẩn Vitek, giám định E. coli
bằng hệ thống phản ứng IMVIC, nếu là E. coli :
- Phản ứng đỏ Methyl: Dương tính (M+), môi trường có mầu đỏ. - Phản ứng Indol: Dương tính (I+), môi trường có mầu đỏ.
- Phản ứng Voges - proskauer: Âm tính (Vi-), không mầu hoặc mầu vàng. - Phản ứng Simmons - Citrat: Âm tính (C-).
Tính kết quả, tra bảng MPN được số gần đúng trực khuẩn E. coli.
3.4.3.2. Phát hiện và tính số lượng vi khuẩn Staphylococcus aureus có trong 1 gram thịt
Áp dụng quy trình TCVN 5156 – 1990 36; lấy mẫu và chuẩn bị mẫu theo TCVN 4833 - 1 2: 2002 32; định danh vi khuẩn bằng máy Vitek.
- Chuẩn bị mẫu:
Lấy 225 gram thịt (loại bỏ mỡ, lấy cả chất lỏng) đồng nhất mẫu với tỷ lệ 1 phần mẫu và 9 phần môi trường BHI bằng máy stomacher, thời gian 1 phút. Huyễn dịch thu được có độ pha loãng là 10-1. Tiếp tục pha loãng mẫu với các đậm độ 10-2, 10-3,... tuỳ theo dự kiến sự ô nhiễm vi khuẩn trong thịt.
- Tiến hành nuôi cấy: Một mẫu xét nghiệm phải cấy ít nhất 3 đậm độ liên tiếp nhau, mỗi đậm độ cấy vào 2 đĩa thạch Bair-parker. Mỗi đậm độ cần kiểm tra, lấy 1ml dịch pha loãng cho vào giữa đĩa thạch, đổ 12 - 15ml thạch 450C vào giữa đĩa petri, xoay và nghiêng đều về các phía để đĩa thạch đông tự nhiên, lật úp đĩa thạch, đặt vào tủ ấm 370C 10C trong 24 - 48 giờ.
Đếm số khuẩn lạc: Căn cứ vào đặc điểm Staphylococcus aureus phát triển tốt trong môi trường Baird - Parker tạo khuẩn lạc màu đen, lồi, tròn, bờ đều, bóng và có vòng trong suốt ở xung quanh do sự dung giải protein của lòng đỏ trứng. Giám định Staphylococcus aureus bằng cách thực hiện các phép thử kiểm tra đặc tính làm đông huyết tương của vi khuẩn.
Thử phản ứng đông vón trên phiến kính. Nhỏ 1 giọt nước muối sinh lý lên phiến kính, dùng que cấy lấy vi khuẩn vừa đủ trộn thành huyễn dịch đục đều, nhỏ tiếp một giọt huyết tương vào thí nghiệm đối chứng một giọt nước muối sinh lý, một giọt huyết tương, sau đó quan sát khả năng đông huyết tương trên phiến kính bằng kính lúp hoặc kính hiển vi.
Trường hợp thử đông vón trên phiến kính là âm tính, có thể làm tiếp phản ứng đông vón trong ống nghiệm. Chọn mỗi loại 5 khuẩn lạc nghi ngờ
Staphylococcus aureus nuôi cấy trong môi trường BHI, để tủ ấm 350 - 370C/24 giờ. Sau đó lấy canh trùng cho vào huyết tương theo tỷ lệ 1:3 (0.1ml canh trùng với 0,3ml huyết tương thỏ) để tủ ấm 37oC trong vòng 2, 4, 6, 8 - 24 giờ và đọc kết quả. Nuôi cấy trên môi trường thạch Chapman, khuẩn lạc Staphylococcus aureus tròn, hơi đục, mặt nhẵn, viền mép gọn, màu vàng.
Kết quả được tính theo công thức:
Xg = Số khuẩn lạc đếm được x
1
x 1
Khối lượng mẫu nuôi cấy Bội số pha loãng mẫu thử
Bảng 3.1. Đánh giá kết quả theo Sperber và Tatini
Huyết tương đông cứng sau 4 - 6h khó di động 4(+) Xác định là Staphylococcus aureus
Huyết tương đông chắc sau 6h dễ di động 3(+) Không được xem là
Staphylococcus aureus
Huyết tương đông thành cục nhỏ sau 24h 2(+) Không được xem là
Staphylococcus aureus
Huyết tương đông thành cục nhỏ không liên kết thành khối
1(+) Không được xem là
Staphylococcus aureus
3.4.3.3. Phát hiện vi khuẩn Salmonella có trong 25 gram thịt
Áp dụng quy trình trong TCVN 5153 - 1990, tham khảo tài liệu của FAO (1992); sử dụng máy định danh vi khuẩn Vitek.
Theo: TCVN 4833 - 1 2 : 2002
Nuôi cấy tăng sinh lựa chọn: Cân 25g thịt không lấy mỡ, bỏ mô liên kết bỏ vào túi PE chuyên dùng, bổ sung vừa đủ 225ml môi trường Muller Kaufman (có thể dùng môi trường thay thế Rappaport, Tetrathionat natri hoặc Selenit), đồng nhất mẫu với môi trường bằng máy Stomacher trong 1 phút, để tủ ấm 370C, thời gian 24 - 48giờ.
đầy canh trùng từ môi trường tăng sinh cấy chuyển sang đĩa môi trường thạch XLD (Xylose Lysine Deoxycholate agar).
Đọc kết quả: Nếu trên môi trường XLD, khuẩn lạc màu hồng có chấm đen ở giữa thì nghi là khuẩn lạc của Salmonella. Lấy khuẩn lạc nghi ngờ cấy chuyển trên môi trường thạch máu để tủ ấm 370C/24 giờ, chọn khuẩn lạc thuần tách biệt, chạy máy Vitek để định danh vi khuẩn Salmonella.
Trường hợp không sử dụng máy Vitek, có thể làm phản ứng sinh vật hoá học để xác định đặc tính sinh hoá của vi khuẩn như sau:
Khuẩn lạc nghi ngờ cấy trên môi trường tam đường sắt (TSI): Dùng que cấy trên mặt thạch, sau đó cấy thẳng đứng sâu xuống đáy ống nghiệm, ủ 370C/24h đọc kết quả. Nếu là vi khuẩn Salmonella, mặt nghiêng ống môi trường TSI có màu đỏ (nghĩa là không phân giải lactose và sucrose). Thân và đáy có màu vàng, có bọt khí và vết nứt (phân giải glucose, sinh hơi), có màu đen (sinh H2S).
Nuôi cấy trên môi trường urê (Christensen): Cấy trên mặt nghiêng thạch, ủ 370C/24 giờ. Salmonella có phản ứng âm tính, môi trường không chuyển màu, phản ứng dương tính môi trường chuyển màu đỏ.
Nuôi cấy trên môi trường Lysin decacboxylas: phản ứng dương tính màu tím, âm tính màu vàng.
Thử Beta - Galactosidas (O.N.P.G): Nhỏ 1 giọt Toluen vào ống nghiệm chứa hỗn dịch 0,25 ml nuớc muối đẳng trương với khuẩn lạc; lắc đều, ủ cách thủy 370C trong 15 phút; nhỏ tiếp 0,25 ml thuốc thử, lắc đều, tiếp tục ủ cách thuỷ 370C trong 24h. Đọc kết quả: Salmonella có phản ứng âm tính, (dung dịch không chuyển màu), dương tính (dung dịch màu vàng).
Thử phản ứng Indol: Cấy vi khuẩn vào môi trường pepton, ủ 370C từ 24 – 48giờ, sau nhỏ 1 ml thuốc thử, đọc kết quả. Salmonella có phản ứng âm tính (màu vàng nhạt), dương tính (màu đỏ).
Thử phản ứng VP (Voges - Proskauer): Cấy vi khuẩn vào môi trường pepton glucose, ủ 370C trong 48 giờ. Chuyển 1 ml canh trùng vào 1 ống nghiệm khác và bổ sung 0,6 ml dung dịch cồn Anpha naptol, 0,2 ml Kalihydroxyt 40%, lắc đều đọc kết quả sau 5 - 15 phút. Salmonella có phản ứng âm tính (không màu hoặc vàng nhạt), dương tính (màu đỏ).
Bảng 3.2. Đặc tính sinh hoá của vi khuẩn Salmonella
STT Tính chất sinh hoá Kết quả thử nghiệm
1 TSI lactose -
2 B-Galactosidas (O.N.P.G) -
3 TSI glucose +
4 TSI glucose sinh hơi +
5 TSI hydro-sulfua +
6 Phân giải urê -
7 Lysin decacboxylas + 8 TSI sucrose - 9 Phản ứng VP - 10 Phản ứng Indol - 3.4.4. Phương pháp xử lý số liệu Xử lý bằng phần mềm Excel 2007.
PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ ĐIỀU TRA THỰC TRẠNG VỆ SINH THÚ Y TẠI CÁC HỘ KINH DOANH THỊT BÒ, LỢN, GÀ Ở 04 CHỢ TẠI THÀNH PHỐ MÓNG KINH DOANH THỊT BÒ, LỢN, GÀ Ở 04 CHỢ TẠI THÀNH PHỐ MÓNG CÁI - QUẢNG NINH
4.1.1. Số lượng thịt gia súc, gia cầm tiêu thụ hàng ngày tại thành phố Móng Cái
4.1.1.1. Số lượng thịt gia súc, gia cầm tiêu thụ hàng ngày tại thành phố Móng Cái Theo số liệu thống kê của Chi cục chăn nuôi và Thú Y tỉnh Quảng Ninh số lượng thịt gia súc, gia cầm tiêu thụ hàng ngày tại các chợ, khu vực điều tra bình quân khoảng 21 tấn/ngày. Qua bảng 4.1 cho thấy quy mô quầy hàng rất đa dạng về số lượng và chủng loại, phần lớn là những quầy hàng nhỏ lẻ manh mún quy mô quầy hàng dưới 20 kg/ngày chiếm phần lớn khoảng 9 tấn/ngày, quầy hàng từ 30 - 40 kg/ngày chiếm 7 tấn/ngày và quầy hàng trên 50 kg/ngày chiếm 4 tấn/ngày. Số lượng tiêu thụ thịt trâu, bò là 3,1 tấn/ngày chiếm 14,62%, thịt lợn khoảng 10,6 tấn/ngày chiếm 50%, thịt gia cầm khoảng 7,5 tấn/ngày chiếm 35,38%.
Bảng 4.1. Số lượng thịt gia súc, gia cầm tiêu thụ hàng ngày tại thành phố Móng Cái TT Quy mô quầy hàng Loại thịt (số lượng bán) Tổng Thịt bò (kg) Thịt lợn (kg) Thịt gà (kg) 1 Dưới 20 kg/ngày 1500 3700 4500 9700 2 30 - 40 kg/ngày 900 4100 2200 7200 3 Trên 50 kg/ngày 700 2800 800 4300 Tổng: 3100 10600 7500 21200
Nguồn: Chi cục Chăn nuôi và Thú Y tỉnh Quảng Ninh Bảng 4.1 cho thấy chỉ tính riêng 04 chợ tại Thành Phố Móng Cái lượng thịt gia súc, gia cầm bán hàng ngày khoảng 13 tấn/ngày, thịt lợn khoảng 6,2
tấn/ngày chiếm 47,15%, thịt trâu bò khoảng 2,7 tấn/ngày chiếm 20,91%, thịt gia cầm khoảng 4,2 tấn/ngày chiếm 31,94%.
4.1.1.2. Số lượng thịt gia súc, gia cầm tiêu thụ hàng ngày tại 04 chợ trên địa bàn Thành phố
Từ kết quả thống kê trên, chúng tôi tiến hành điều tra khảo sát thực trạng điều kiện vệ sinh thú y tại các quầy kinh doanh thịt gia súc, gia cầm bán ở một số chợ để kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật trên thịt bò, lợn, gà.
Để đánh giá các tiêu chí trên chúng tôi dựa vào "Quy chuẩn kỹ thuật vệ sinh thú y đối với cơ sở kinh doanh thịt gia súc gia cầm tươi sống". Kết quả điều tra được tổng hợp ở các bảng sau.
Bảng 4.2. Số lượng thịt gia súc, gia cầm tiêu thụ hàng ngày tại 04 chợ trên địa bàn Thành phố
STT Đơn vị Thịt bò (kg) Thịt lợn (kg) Thịt gia cầm (kg) Tổng 1 Chợ Hải Đông 700 1.600 900 3.200 2 Chợ Hải Hòa 500 1.100 700 2.300 3 Chợ Ka Long 650 1.500 1.100 3.250 4 Chợ Trung Tâm 900 2.000 1.500 4.400 Tổng: 2.750 6.200 4.200 13.150
Nguồn: Chi cục Chăn nuôi và Thú Y Quảng Ninh 4.1.1.3. Loài hình kinh doanh và quy mô quầy hàng
Qua kết quả điều tra khảo sát thể hiện dưới bảng 4.3 cho thấy số lượng thịt gia súc gia cầm tiêu thụ hàng ngày trên địa bàn 04 chợ là rất lớn, thực trạng về vệ sinh thú y của các hộ kinh doanh, buôn bán thịt gia súc, gia cầm không đạt yêu cầu, từ địa điểm đến phương tiện vận chuyển đặc biệt là 02 chợ Hải Hòa và Ka Long.
Bảng 4.3. Loại hình kinh doanh và quy mô quầy hàng
Danh mục điều tra
Chợ Hải Đông Chợ Hải Hòa Chợ Ka Long Chợ Trung Tâm Tổng hợp
Số hộ KD Tỷ lệ % Số hộ KD Tỷ lệ % Số hộ KD Tỷ lệ % Số hộ KD Tỷ lệ % Số hộ KD Tỷ lệ %
Loại hình kinh doanh: 76 48 50 106 280