Hiệu lực của vắc xin là một trong những chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng của vắc xin. Vắc xin có chất lượng tốt ngoài chỉ tiêu cảm quan, thuần khiết, an toàn cần có hiệu lực, bảo hộ được đàn vịt khi sử dụng.
Để kiểm nghiệm hiệu lực của vắc xin, chúng tôi áp dụng theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8685-2:2011về "Quy trình kiểm nghiệm vắc xin Viêm gan siêu vi trùng vịt". Sử dụng giống cường độc viêm gan vịt để thử thách kiểm tra tính bảo hộ
của vắc xin (theo mục 4.4.1 Phương pháp trọng tài TCVN 8685-2:2011).
Tiêm dưới da cho cho 20 vịt, mỗi con 1 liều vắc xin ghi trên nhãn và 20 vịt đối chứng không tiêm vắc xin.
Sau 72 giờ sử dụng vắc xin, 20 vịt miễn dịch và 20 vịt đối chứng được thử thách với vi rút viêm gan vịt cường độc (chủng Quốc gia đang lưu giữ tại Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y TW1), liều 103,0 LD50/con, vào dưới da.
Lô vắc xin được đánh giá là đạt khi ít nhất 80 % vịt miễn dịch sống và ít nhất 80 % vịt đối chứng chết.
Theo dõi 10 ngày sau khi công cường độc. Kết quả công cường độc được trình bày ở bảng 4.8 và hình 4.8:
Hình 4.8: Vịt ở lô gây miễn dịch (dấu đầu xanh) khoẻ mạnh và vịt lô đối
chứng chết (ảnh chụp tại Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y TW1).
Bảng 4.8. Kết quả công cường độc bằng virus Viêm gan vịt cường độc
Các chỉ tiêu theo dõi Lô thí nghiệm Lô đối chứng
Số vịt thí nghiệm (con) 20 20
Đường đưa vắc xin Tiêm dưới da Không tiêm
Số vịt công cường độc (con) 20 20
Liều công cường độc 103,0LD50/con
Thời gian theo dõi (ngày) 14 14
Số vịt có triệu chứng lâm sàng và (hoặc)
chết (con) 0 18
Số vịt sống sau khi công cường độc (con) 20 2
Qua kết quả ở bảng 4.8 cho thấy:
Ở lô miễn dịch 20 vịt được sử dụng 1 liều vắc xin theo quy định, sau 10 ngày công cường độc 20/20 vịt sống khỏe, tỷ lệ bảo hộ đạt 100%. Trong khi đó, 18 vịt (tỷ lệ 90%) ở lô đối chứng không sử dụng vắc xin chết với triệu chứng, bệnh tích điển hình của bệnh Viêm gan vịt như: Vịt chết nhanh với tỷ lệ chết rất cao và chết ở trạng thái đặc biệt đầu ngoẹo về một bên, 2 chân duỗi thẳng. Mổ khám thấy gan sưng to, xuất huyết lốm đốm trên gan, có điểm hoại tử. Điều đó chứng tỏ rằng, vịt của lô miễn dịch được sử dụng vắc xin Viêm gan vịt nhược độc đã tạo ra đáp ứng miễn dịch giúp vịt bảo hộ chống lại virus Viêm gan vịt cường độc khi thử thách cường độc.
Theo Hướng dẫn của OIE, vịt khi được gây miễn dịch với liều vắc xin 103,3ELD50 dưới da, sau 72 giờ được thử thách bằng chủng cường độc viêm gan vịt với liều 103,0LD50 cho mỗi con vịt. Ít nhất 80% vịt miễn dịch được bảo hộ. Tỷ lệ vịt đối chứng phải chết ít nhất 80% là được chấp nhận.
Đối chiếu theo Tiêu chuẩn Việt Nam về kiểm nghiệm - TCVN 8685- 2:2011, vắc xin Viêm gan vịt nhược độc đông khô do công ty Vetvaco sản xuất đã đạt chỉ tiêu hiệu lực phòng bệnh Viêm gan vịt. Qua kết quả này đã chứng tỏ giống cường độc Viêm gan vịt sau thời gian tăng cường và lưu giữ vẫn giữ được đặc tính sinh vật học, đặc tính kháng nguyên, tính độc của giống.
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN
Từ các kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi rút ra được những kết luận sau: - Giống virus Viêm gan vịt không bị tạp với các vi khuẩn hay gặp.
- Về độ tinh khiết: giống không lẫn Mycoplasma và Salmonella.
- Chất lượng giống virus Viêm gan vịt cường độc thông qua chỉ tiêu giữ ELD50 ổn định trong các môi trường nước trứng vịt, nước trứng gà, tế bào xơ phôi vịt và tế bào xơ phôi gà.
- Liều gây chết 50% vịt (LD50): 106,31
- Đã giải mã gen kháng nguyên VP1 của chủng viêm gan vịt cường độc. Gen kháng nguyên VP1 của chủng virus viêm gan vịt cường độc có độ dài là 720 bp và được xác định thuộc genotype III (DHAV-3).
- Đã giải mã toàn bộ hệ gen của virus Viêm gan vịt. Thu được toàn bộ hệ gen virus viêm gan vịt cường độc gồm 7777 nucleotide.
- Sử dụng giống virus Viêm gan vịt cường độc trong kiểm nghiệm vắc xin với liều công liều 103,0 LD50 cho kết quả tương đồng khi đối chiếu theo Tiêu chuẩn Việt Nam - TCVN 8685-2:2011, Tiêu chuẩn ASEAN (2012 update) và OIE (2014).
- Sau thời gian lưu giữ và bảo tồn giống virus Viêm gan vịt cường độc vẫn giữ được đầy đủ các đặc tính về sinh vật học, sinh học phân tử. Đáp ứng đầy đủ các tiêu chí của giống vi sinh vật trong ngân hàng giống quốc gia.
5.2. ĐỀ NGHỊ
1. Tiếp tục nghiên cứu phương pháp tăng cường giống trên các loại môi trường tế bào nhằm thay thế phương pháp tăng cường trên bản động vật nhưng vẫn đảm bảo giữ được đặc tính ổn định của giống vi sinh vật.
2. Tiếp tục nghiên cứu cấu trúc sinh học phân tử của giống Viêm gan vịt cường độc, theo dõi sự thay đổi khác biệt với các chủng Viêm gan vịt đang lưu giữ tại ngân hàng gen trên thế giới.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Bùi Thanh Khiết (2007). Nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin viêm gan vịt từ
chủng virus vacxin nhược độc DH - EG - 2000 và ứng dụng phòng, can thiệp dịch vào thực tế sản xuất. Luận văn thạc sỹ nông nghiệp. Trường Đại học nông nghiệp I.
2. Lê Thanh Hoà, Nguyễn Như Thanh và Nguyễn Bá Hiên (1984). Đặc tính sinh
học của giống virus vacxin viêm gan vịt chủng TN của Asplin và vacxin phòng bệnh ở Việt Nam. Tạp chí Khoa học và kỹ thuật Thú y, 2, (1-1985), tr. 21-25.
3. Nguyễn Bá Hiên (2007). Khảo sát một số đặc tính sinh học của chủng virus viêm
gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 và bước đầu nghiên cứu chế tạo vacxin phòng bệnh. Tạp chí Khoa học và kỹ thuật thú y 14(2), hội thú y Việt Nam, tr. 11-15.
4. Nguyễn Đức Lưu, Vũ Như Quán (2002). Bệnh viêm gan virus vịt. Tạp chí Khoa
học kỹ thuật thú y, 9(1), Hội thú y Việt Nam, tr.87-90.
5. Nguyễn Đường, Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Khắc Tuấn, Nguyễn Thị Bích
Lộc, Nguyễn Bá Hiên (1990). Vi sinh vật đại cương. NXB Nông Nghiệp, Hà Nội
6. Nguyễn Hữu Vũ, Nguyễn Đức Lưu, Trần Thị Thu Hiền, Nguyễn Khánh Ly
(2001). Kết quả sử dụng kháng thể viêm gan vịt phòng trị bệnh cho vịt ngan. Khoa học và kỹ thuật thú y, tập VIII số 4, Hội thú y Việt Nam, tr 52- 58
7. Nguyễn Luận (2008). Xác định đặc tính sinh học phân tử gen VP1 của các
chủng virus vacxin viêm gan vịt ở Việt Nam và so sánh với một số chủng khác của thế giới. Luận văn thạc sỹ nông nghiệp. Trường Đại học nông nghiệp I.
8. Nguyễn Phục Hưng (2004). Tình hinh mắc bệnh viêm gan vịt do virus ở một số
tỉnh đồng bằng Bắc Bộ. Phân lập virus gây bệnh, nghiên cứu đặc tính sinh học của chủng virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 và quy trình sản xuất vacxin. Luận văn thạc sỹ nông nghiệp. Trường Đại học nông nghiệp I.
9. Nguyễn Thát (1975). Bệnh gia cầm. NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội
10. Nguyễn Văn Cảm, Nguyễn Thị Thu Hà và Nguyễn Khánh Ly (2001). Nghiên
cứu biến đổi bệnh lý bệnh viêm gan virus vịt. Khoa học và kỹ thuật Thú y, 8(4), Hội thú y Việt Nam, tr. 48-51.
12. TCVN 8685-2:2011. Quy trình kiểm nghiệm vacxin-phần II: Vacxin viêm gan siêu vi trùng vịt
13. Trần Minh Châu và Lê Thu Hồng (1985). Thăm dò tạo chủng vacxin nhược độc
Viêm gan vịt bằng chủng virus phân lập tại địa phương. Tạp chí KHKT Thú y, Tập 4 (3-1985), tr.3-8
14. Trần Thị Lan Hương, Phạm Thị Hường, Nguyễn Bá Hiên (2008). Ảnh hường
của miễn dịch thụ động viêm gan vịt đến đáp ứng miễn dịch củ vịt con khi tiêm liều vacxin đầu tiên. Tạp chí Khoa học và phát triển, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, 6(4), tr. 338-342.
15. Vũ Triệu An (1997). Miễn dịch học. NXB Y học. Hà Nội
Tiếng Anh
16. Adamiker D. (1969). Elektronenmikros kopiscle untersuchungen zus
virushepatitis der Etenkken, Zentrabl Veterianezmed [B] 16: 620-636.
17. Adamiker D. (1970). Die Virushepatitis der Entenkken im
elektronenmikroskopischen Bild, Teil II: Befunde an der Milz und am Muskei. Zentralbl Veterinaermed [B] 17: 880-889
18. Aspin F.D (1958), An attenuated strain ò duck hepatitis virus , Vet Rec 70, pp.
1226-1230
19. Asplin F.D (1961). Notes on epidemiology and wacination for virus hepatitis of
ducks. Epizôt bull 56,pp.793-800
20. Asplin F.D (1970). Examination of sera from wild fowl for antibodies against the
viruses of duck plague duck hepatitis and duck influenza, Vet Rec 87, pp. 182-183.
21. Asplin, F.D. (1965). Duck hepatitis: Vaccination against two serological types,
Veterinary Record, 87, pp. 182-183.
22. Ding C and Zhang D (2007). Molecular analysis of duck hepatitis virus type 1,
Virology 361, pp. 9-17.
23. Fabricant J and Levine P.P (2002). Duck virus hepatitis, Diseases of Poultry, (9th
Ed), Lowa State University Press, Ames, Lowa, U.S.A.
24. Fabricant J, Rickard C.G and Levine P.P (1957). The pathology of duck virus
hepatitis, Avian Diseases, pp. 256-275.
25. Ghazi F, Hughes P.J, Hyypiä T and Stanway G (1998). Molecular analysis of
26. Golubnichi V.P. and G.V. Malinovskaya (1984). Dynamics of postvaccinal antibodies in blood serum against duck hepatitis virus, Vet Nauk Proiz (Minsk) 22, pp. 72-75. (Abstr Agro Salekt 1985: 1973).
27. Gough R.E and Spackman D (1981). Studies with inactivated duck virus
hepatitis vacxins in breeder ducks, Avian Pathol 10, pp. 471-479.
28. Haider S.A. and B.W. Calnek (1979). “In vitro isolation, propagation and
characterization of duck hepatitis virus type III” Avian disease, 23, pp. 715-729.
29. Hwang, J. (1973). Active immunization against duck hepatitis virus. Amj Vet
Res 33, pp. 2539-2544.
30. enkins K.A, Bean A.G and Lowenthal J.W (2007). Avian genomics and the
innate immune response to viruses, Cytogenet Genome Res 117, pp. 207-212.
31. Jenkins K.A, Bean A.G and Lowenthal J.W (2007). Avian genomics and the
innate immune response to viruses, Cytogenet Genome Res 117, pp. 207-212.
32. Johansson S, Niklasson B, Tesh R.B, Shafren D.R, Travassos da Rosa A.A and
Lindberg A.M (2003). Molecular characterization of M 1146, an American isolate of Ljungan virus (LV) reveals the presence of a new LV genotype, Virol 84, pp. 837-844.
33. Levine, P.P. and J. Fabricant (1950). Virus disease in ducks in North America,
Cornell Veterinary, 40, pp.71- 86.
34. Oberste M.S, Maher K, Kennett M.L, Campbell J.J, Carpenter M.S, Schnurr D
and Pallansch M.A (1999). Molecular epidemiology and genetic diversity of echovirus type 30 (E30): genotypes correlate with temporal dynamics of E30 isolation, J Clin Microbiol 37, pp. 3928-3933.
35. OIE (2000). Manual of Standards for diagnostic test and vacxins.
36. OIE (2006). Annual animal disease status.
37. Priz N.N (1973). Comparative study of virus hepatitis in animals (dogs and
ducks) using different routes of influence, Vopr Virusol 6, pp. 696-700.
38. Reuss U (1959). Versuche zur aktiven und passiven Immunisierung bei der
Virus hepatitis der Entenkuken, Zentrabl Veterinaermed 6, pp. 808-815.
39. Toth, T.E. (1969). Studies of an agent causing mortality among ducklings immune
to duck virus hepatitis, Avian Diseases, 13, pp. 535- 539.
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Quy trình bảo quản và sử dụng giống virus Viêm gan vịt cường độc TRUNG TÂM KIỂM NGHIỆM THUỐC
THÚ Y TWI
Số hiệu: STCL/QT/KN1 Số ban hành:
QUY TRÌNH Trang: ½
BẢO QUẢN VÀ SỬ DỤNG
GIỐNG VI RÚT VIÊM GAN VỊT CƯỜNG ĐỘC
Ngày ban hành: Ngày sửa đổi:
1. Phạm vi áp dụng
Quy trình này quy định các yêu cầu kỹ thuật trong việc bảo quản và sử dụng giống vi rút Viêm gan vịt cường độc.
2. Yêu cầu kỹ thuật của giống vi rút Viêm gan vịtcường độc
2.1. Nhận dạng: Dùng phản ứng ELISA phát hiện kháng nguyên. Nếu phản ứng cho kết
quả dương tính thì đạt yêu cầu.
2.2. Thuần khiết:
2.2.1.Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn:
- Cấy vi rút trên 2 ống môi trường kiểm tra sau đây: môi trường thioglycollat, môi trường trypticaza đậu tương, 2 đĩa môi trường thạch máu, lượng vi rút cấy từ 1 % đến 2 % (phần thể tích) so với môi trường kiểm tra.
- Ủ môi trường đã cấy vi rút trong tủ ở 37 oC, theo dõi từ 7 ngày đến 10 ngày.
- Giống vi rút được xem là đạt tiêu chuẩn khi không có bất cứ vi sinh vật nào mọc trên môi trường kiểm tra trong thời gian theo dõi.
2.2.2.Kiểm tra tạp nhiễm nấm mốc:
- Mẫu vi rút được ria cấy trên môi trường thạch Sabouraud hoặc sản phẩm thủy
phân casein đậu tương. Theo dõi 14 ngày ở nhiệt độ phòng (từ 20 0C đến 25 0C).
- Giống vi rút được xem là đạt tiêu chuẩn khi không có bất cứ tạp khuẩn nấm mốc nào mọc trên môi trường kiểm tra trong thời gian theo dõi.
2.2.3. Kiểm tra tạp nhiễm Mycoplasma
- Mẫu vi rút được cấy kiểm tra trên môi trường canh thang PPLO với nồng độ
từ 1 % đến 2 % vi rút trong 100 ml môi trường và trên đĩa thạch PPLO có bổ sung huyết thanh ngựa và chất chiết nấm men với thể tích 0,1 ml vi rút trên 1 đĩa. Có thể sử
dụng dung dịch DPN-cystein, được bổ sung nicotinamid adenin dinucleotid, L-cystein hydroclorua và huyết thanh ngựa hoặc sử dụng môi trường canh thang tim được bổ sung proteoza pepton và chất chiết nấm men để làm môi trường kiểm tra.
Theo dõi môi trường lỏng trong 14 ngày ở nhiệt độ từ 33 0C đến 37 0C. Tại các thời điểm 3 ngày, 7 ngày, 10 ngày và 14 ngày, lấy canh khuẩn ở môi trường lỏng trên ria cấy
vào môi trường thạch PPLO (2 đĩa). Ủ trong tủ ấm CO2 ở 37 0C có 5 % khí CO2, theo
dõi trong 28 ngày.
- Mẫu vi rút được xem là đạt khi không có khuẩn lạc Mycoplasma mọc trên môi
trường kiểm tra.
2.2.4.Kiểm tra tạp nhiễm Salmonella
- Mẫu vi rút được cấy trên môi trường kiểm tra, dùng một trong các loại
môi trường sau: thạch MacConkey, thạch Salmonella-Shigella, thạch Brilliant Green, thạch desoxycholat xitrat hoặc thạch XLD, với nồng độ từ 1 % đến 2 % dung tích môi trường kiểm tra.
- Ủ môi trường đã cấy vi rút trong tủ ở 37 oC, theo dõi từ 18 h đến 24 h sau đó cấy
chuyển tiếp sang ống môi trường nước, dùng một trong các loại môi trường sau: canh thang selenit hoặc canh thang tetrathionat. Ủ trong tủ ở 37 oC, theo dõi từ 48 h đến 72h.
Mẫu vi rút được xem là đạt khi không có vi khuẩn Salmonella mọc trên các loại
môi trường kiểm tra.
2.3. Độc lực:
- Bệnh tích điển hình ở gan vịt con dưới 1 tuần tuổi và phôi - LD50/ml = 106,3
3.Bảo quản giống vi rút
- Giống vi rút sau khi kiểm tra đạt tiêu chuẩn ở mục 2. thì tiến hành bảo quản
giống bằng phương pháp giữ tươi hoặc đông khô.
- Giống vi rút Viêm gan vịt cường độc được bảo quản ở nhiệt độ ≤ -500C
- Giống đông khô thì 2 năm tăng cường 1 lần, giống tươi thì 6 tháng tăng cường 1 lần.
- Mỗi tủ lạnh bảo quản giống vi rút phải có sổ theo dõi riêng, trong đó ghi chép đầy đủ các thông tin: Nhiệt độ lạnh hàng ngày, số lô sản xuất, hạn sử dụng, số lượng tổng, số lượng xuất, số lượng còn dư,...
- Hàng ngày phải kiểm tra nơi bảo quản giống vi rút, phải đảm bảo nguồn điện ổn định, máy lạnh hoạt động tốt. Có máy phát điện dự phòng khi có sự cố mất điện, các ổ cắm điện phải chắc chắn không bị lỏng để tránh mất điện cho tủ bảo quản.
- Giống vi rút trong quá trình vận chuyển được bảo quản trong thùng xốp có đá khô hoặc trong các xe lạnh chuyên dụng, không được mở thùng giống vi rút trong lúc vận chuyển để tránh giống vi rút tiếp xúc với nhiệt độ cao dẫn đến giảm độc lực của giống.
4. Sử dụng giống vi rút
- Đọc kỹ các thông tin trên lọ giống
- Giống đông khô thì 2 năm tăng cường 1 lần, giống tươi thì 6 tháng tăng cường 1 lần. - Giống vi rút cường độc Viêm gan vịt dùng gây bệnh cho vịt từ 3 – 7 ngày tuổi.