CÔNG TÁC KIỂM NGHIỆM
Sau khi đã xác định được một số đặc tính sinh học của giống Viêm gan vịt cường độc chúng tôi sử dụng để kiểm nghiệm vắc xin Viêm gan vịt nhược độc đông khô.
Vắc xin viêm gan vịt nhược độc là loại được làm giảm độc qua tiêm truyền nhiều lần qua động vật ít cảm thụ, qua phôi. Virus vẫn có khả năng nhân lên trong cơ thể vật chủ nhưng không gây bệnh nên được dùng để làm vắc xin.
Bằng phương pháp giảm độc trên phôi đã tạo ra nhiều chủng virus viêm gan vịt nhược độc. Hiện nay, vắc xin viêm gan vịt nhược độc dùng chủ yếu ở Châu Âu là loại đã được giảm độc sau 53 - 55 lần tiếp truyền qua phôi gà 8 -10 ngày
tuổi; ở Mỹ là loại giảm độc sau 84 - 89 lần cấy truyền. Vắc xin được bảo quản ở nhiệt độ âm 700C trong vài năm.
Trên thị trường Việt Nam đang sử dụng rộng rãi nhiều loại vắc xin nhược độc viêm gan vịt do các công ty Vetvaco, Navetco, Marphavet và RTD. Những khảo sát sinh học phân tử hệ gen bước đầu cho thấy, chủng virus được sử dụng làm vắc xin có nguồn gốc từ Hàn Quốc, Ai Cập, Mỹ, Trung Quốc... Ngoài ra, một chủng virus vắc xin nhược độc khác của Học viện Nông nghiệp Việt Nam cũng đã được nghiên cứu đầy đủ về đặc tính sinh học (Nguyễn Phục Hưng, 2004; Nguyễn Bá Hiên, 2007).
Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng nguyên liệu sau:
- Chuẩn bị chủng cường độc viêm gan vịt: Chủng đã được xác định đặc tính sinh học và sinh học phân tử thuộc nhóm DHAV-3.
Chủng cường độc được chuẩn độ với liều công: 103,0 LD50
- Vắc xin: Viêm gan vịt nhược độc đông khô, Công ty Vetvaco sản xuất.
- Liều sử dụng:
+ Tiêm dưới da hoặc tiêm bắp, 1 liều: 0,3 ml/con
Để tiêm phòng có hiệu quả, việc xác định được thời điểm sử dụng vắc xin là vô cùng quan trọng. Những trường hợp sử dụng vắc xin không đúng cách, thiếu thông tin sẽ gây nên sự bất lợi cho việc nghiên cứu lưu hành bệnh trong đàn. Vắc xin thú y chỉ được cấp phép lưu hành khi đã được vượt qua các bước kiểm tra nghiêm ngặt đó là kiểm nghiệm trong phòng thí nghiệm và khảo nghiệm trên thực địa.
Phương pháp vàng trong kiểm tra chất lượng vắc xin đang được áp dụng tại phòng thí nghiệm Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y TW1. Để ứng dụng chủng
Mỗi liều Vắc xin chứa:
- Virus Viêm gan vịt serotype I ≥ 103,3 ELD50
- Thành phần chất bổ trợ:
+ Sữa tách bơ (Skim milk): 0,001 mg + Streptomycine: 500 µg + Penicilin: 500 UI
cường độc viêm gan vịt trong kiểm nghiệm, chúng tôi tiến hành kiểm tra một số chỉ tiêu của vắc xin trước khi tiêm cho đàn vịt thí nghiệm.
4.2.1. Kết quả kiểm tra cảm quan
Kiểm tra bằng mắt thường: Vắc xin có màu trắng hồng, dạng bánh xốp, dễ tách khỏi thành lọ, kín, có chân không, dễ tan khi pha trở lại.
4.2.2. Kết quả kiểm tra thuần khiết
4.2.2.1. Kết quả kiểm tra vô trùng
Kiểm tra chỉ tiêu vô trùng cho vắc xin trước khi đưa vào thử nghiệm là một bước bắt buộc trong quy trình sản xuất vắc xin.
Để kiểm tra chỉ tiêu vô trùng, chúng tôi lấy vắc xin Viêm gan vịt nhược độc đông khô hoàn nguyên bằng nước sinh lý 0,9%, tiến hành kiểm tra vô trùng trên 5 loại môi trường cơ bản là thạch máu, thạch nấm, thạch thường, nước thịt và yếm khí. Mỗi loại môi trường 2 ống, lượng vắc xin cấy kiểm tra bằng 1–2% dung tích môi trường.
Theo dõi 7 -10 ngày ở 370C, riêng thạch nấm để nhiệt độ phòng. Kết quả kiểm tra vô trùng được thể hiện ở bảng 4.6.
Bảng 4.6: Kết quả kiểm tra vô trùng vắc xin Viêm gan vịt nhược độc
MT Ngày Thạch máu Thạch nấm Thạch thường Nước thịt Yếm khí 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 - - - - - - - - - - 2 - - - - - - - - - - 3 - - - - - - - - - - 4 - - - - - - - - - - 5 - - - - - - - - - - 6 - - - - - - - - - - 7 - - - - - - - - - - Kết quả Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt
Ghi chú : (-) âm tính: không có vi khuẩn hoặc nấm mọc
Kết quả từ bảng 4.6 cho thấy qua 10 ngày theo dõi trên các môi trường, kết quả cả 5 loại môi trường kiểm tra đều không có vi khuẩn, nấm. Do đó chúng tôi sơ bộ kết luận rằng vắc xin Viêm gan vịt nhược độc đông khô đảm bảo độ vô trùng.
4.2.3. Kiểm tra tính an toàn của vắc xin (Theo TCVN 8685-2:2011)
Yêu cầu đối với một loại vắc xin là phải an toàn và không gây phản ứng bất thường nào đối với con vật được sử dụng. Để kiểm tra tính an toàn, chúng tôi sử dụng 20 vịt con 3 ngày tuổi, tiêm dưới da hoặc bắp thịt cho mỗi con được tiêm 10 liều vắc-xin quy định. Theo dõi 14 ngày, tất cả vịt phải sống khoẻ.
Kết quả kiểm tra an toàn được trình bày ở bảng 4.7.
Bảng 4.7: Kết quả kiểm tra an toàn vắc xin Viêm gan vịt nhược độc
Vắc xin Đường gây
nhiễm Động vật thí nghiệm Liều dùng Thời gian theo dõi Kết quả Kết luận Sống Chết Viêm gan vịt nhược độc đông khô Tiêm dưới da Vịt con 3 ngày tuổi 10 liều 14 ngày 20/20 0/20 Đạt
Với kết quả thu được ở trên, vắc xin Viêm gan vịt nhược độc đạt tiêu chuẩn về độ an toàn theo mục 4.3 TCVN 8685-2:2011. So sánh với Hướng dẫn của OIE thử vắc xin trên cùng đối tượng và liều dùng (10 liều vắc xin thử an toàn). Quan sát trong vòng 10 đến 21 ngày, tất cả vịt đều sống khoẻ và không bị tác động của vắc xin. Như vậy, kết quả thu được trong thí nghiệm là tưg đương so với tiêu chuẩn quốc tế.
Sau khi đã tiến hành kiểm tra một số chỉ tiêu: cảm quan, thuần khiết chúng tôi dùng giống Viêm gan vịt cường độc kiểm tra hiệu lực vắc xin bằng phương pháp công cường độc.
4.2.4. Kết quả kiểm tra hiệu lực bằng phương pháp công cường độc
Hiệu lực của vắc xin là một trong những chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng của vắc xin. Vắc xin có chất lượng tốt ngoài chỉ tiêu cảm quan, thuần khiết, an toàn cần có hiệu lực, bảo hộ được đàn vịt khi sử dụng.
Để kiểm nghiệm hiệu lực của vắc xin, chúng tôi áp dụng theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8685-2:2011về "Quy trình kiểm nghiệm vắc xin Viêm gan siêu vi trùng vịt". Sử dụng giống cường độc viêm gan vịt để thử thách kiểm tra tính bảo hộ
của vắc xin (theo mục 4.4.1 Phương pháp trọng tài TCVN 8685-2:2011).
Tiêm dưới da cho cho 20 vịt, mỗi con 1 liều vắc xin ghi trên nhãn và 20 vịt đối chứng không tiêm vắc xin.
Sau 72 giờ sử dụng vắc xin, 20 vịt miễn dịch và 20 vịt đối chứng được thử thách với vi rút viêm gan vịt cường độc (chủng Quốc gia đang lưu giữ tại Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y TW1), liều 103,0 LD50/con, vào dưới da.
Lô vắc xin được đánh giá là đạt khi ít nhất 80 % vịt miễn dịch sống và ít nhất 80 % vịt đối chứng chết.
Theo dõi 10 ngày sau khi công cường độc. Kết quả công cường độc được trình bày ở bảng 4.8 và hình 4.8:
Hình 4.8: Vịt ở lô gây miễn dịch (dấu đầu xanh) khoẻ mạnh và vịt lô đối
chứng chết (ảnh chụp tại Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y TW1).
Bảng 4.8. Kết quả công cường độc bằng virus Viêm gan vịt cường độc
Các chỉ tiêu theo dõi Lô thí nghiệm Lô đối chứng
Số vịt thí nghiệm (con) 20 20
Đường đưa vắc xin Tiêm dưới da Không tiêm
Số vịt công cường độc (con) 20 20
Liều công cường độc 103,0LD50/con
Thời gian theo dõi (ngày) 14 14
Số vịt có triệu chứng lâm sàng và (hoặc)
chết (con) 0 18
Số vịt sống sau khi công cường độc (con) 20 2
Qua kết quả ở bảng 4.8 cho thấy:
Ở lô miễn dịch 20 vịt được sử dụng 1 liều vắc xin theo quy định, sau 10 ngày công cường độc 20/20 vịt sống khỏe, tỷ lệ bảo hộ đạt 100%. Trong khi đó, 18 vịt (tỷ lệ 90%) ở lô đối chứng không sử dụng vắc xin chết với triệu chứng, bệnh tích điển hình của bệnh Viêm gan vịt như: Vịt chết nhanh với tỷ lệ chết rất cao và chết ở trạng thái đặc biệt đầu ngoẹo về một bên, 2 chân duỗi thẳng. Mổ khám thấy gan sưng to, xuất huyết lốm đốm trên gan, có điểm hoại tử. Điều đó chứng tỏ rằng, vịt của lô miễn dịch được sử dụng vắc xin Viêm gan vịt nhược độc đã tạo ra đáp ứng miễn dịch giúp vịt bảo hộ chống lại virus Viêm gan vịt cường độc khi thử thách cường độc.
Theo Hướng dẫn của OIE, vịt khi được gây miễn dịch với liều vắc xin 103,3ELD50 dưới da, sau 72 giờ được thử thách bằng chủng cường độc viêm gan vịt với liều 103,0LD50 cho mỗi con vịt. Ít nhất 80% vịt miễn dịch được bảo hộ. Tỷ lệ vịt đối chứng phải chết ít nhất 80% là được chấp nhận.
Đối chiếu theo Tiêu chuẩn Việt Nam về kiểm nghiệm - TCVN 8685- 2:2011, vắc xin Viêm gan vịt nhược độc đông khô do công ty Vetvaco sản xuất đã đạt chỉ tiêu hiệu lực phòng bệnh Viêm gan vịt. Qua kết quả này đã chứng tỏ giống cường độc Viêm gan vịt sau thời gian tăng cường và lưu giữ vẫn giữ được đặc tính sinh vật học, đặc tính kháng nguyên, tính độc của giống.
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN
Từ các kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi rút ra được những kết luận sau: - Giống virus Viêm gan vịt không bị tạp với các vi khuẩn hay gặp.
- Về độ tinh khiết: giống không lẫn Mycoplasma và Salmonella.
- Chất lượng giống virus Viêm gan vịt cường độc thông qua chỉ tiêu giữ ELD50 ổn định trong các môi trường nước trứng vịt, nước trứng gà, tế bào xơ phôi vịt và tế bào xơ phôi gà.
- Liều gây chết 50% vịt (LD50): 106,31
- Đã giải mã gen kháng nguyên VP1 của chủng viêm gan vịt cường độc. Gen kháng nguyên VP1 của chủng virus viêm gan vịt cường độc có độ dài là 720 bp và được xác định thuộc genotype III (DHAV-3).
- Đã giải mã toàn bộ hệ gen của virus Viêm gan vịt. Thu được toàn bộ hệ gen virus viêm gan vịt cường độc gồm 7777 nucleotide.
- Sử dụng giống virus Viêm gan vịt cường độc trong kiểm nghiệm vắc xin với liều công liều 103,0 LD50 cho kết quả tương đồng khi đối chiếu theo Tiêu chuẩn Việt Nam - TCVN 8685-2:2011, Tiêu chuẩn ASEAN (2012 update) và OIE (2014).
- Sau thời gian lưu giữ và bảo tồn giống virus Viêm gan vịt cường độc vẫn giữ được đầy đủ các đặc tính về sinh vật học, sinh học phân tử. Đáp ứng đầy đủ các tiêu chí của giống vi sinh vật trong ngân hàng giống quốc gia.
5.2. ĐỀ NGHỊ
1. Tiếp tục nghiên cứu phương pháp tăng cường giống trên các loại môi trường tế bào nhằm thay thế phương pháp tăng cường trên bản động vật nhưng vẫn đảm bảo giữ được đặc tính ổn định của giống vi sinh vật.
2. Tiếp tục nghiên cứu cấu trúc sinh học phân tử của giống Viêm gan vịt cường độc, theo dõi sự thay đổi khác biệt với các chủng Viêm gan vịt đang lưu giữ tại ngân hàng gen trên thế giới.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Bùi Thanh Khiết (2007). Nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin viêm gan vịt từ
chủng virus vacxin nhược độc DH - EG - 2000 và ứng dụng phòng, can thiệp dịch vào thực tế sản xuất. Luận văn thạc sỹ nông nghiệp. Trường Đại học nông nghiệp I.
2. Lê Thanh Hoà, Nguyễn Như Thanh và Nguyễn Bá Hiên (1984). Đặc tính sinh
học của giống virus vacxin viêm gan vịt chủng TN của Asplin và vacxin phòng bệnh ở Việt Nam. Tạp chí Khoa học và kỹ thuật Thú y, 2, (1-1985), tr. 21-25.
3. Nguyễn Bá Hiên (2007). Khảo sát một số đặc tính sinh học của chủng virus viêm
gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 và bước đầu nghiên cứu chế tạo vacxin phòng bệnh. Tạp chí Khoa học và kỹ thuật thú y 14(2), hội thú y Việt Nam, tr. 11-15.
4. Nguyễn Đức Lưu, Vũ Như Quán (2002). Bệnh viêm gan virus vịt. Tạp chí Khoa
học kỹ thuật thú y, 9(1), Hội thú y Việt Nam, tr.87-90.
5. Nguyễn Đường, Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Khắc Tuấn, Nguyễn Thị Bích
Lộc, Nguyễn Bá Hiên (1990). Vi sinh vật đại cương. NXB Nông Nghiệp, Hà Nội
6. Nguyễn Hữu Vũ, Nguyễn Đức Lưu, Trần Thị Thu Hiền, Nguyễn Khánh Ly
(2001). Kết quả sử dụng kháng thể viêm gan vịt phòng trị bệnh cho vịt ngan. Khoa học và kỹ thuật thú y, tập VIII số 4, Hội thú y Việt Nam, tr 52- 58
7. Nguyễn Luận (2008). Xác định đặc tính sinh học phân tử gen VP1 của các
chủng virus vacxin viêm gan vịt ở Việt Nam và so sánh với một số chủng khác của thế giới. Luận văn thạc sỹ nông nghiệp. Trường Đại học nông nghiệp I.
8. Nguyễn Phục Hưng (2004). Tình hinh mắc bệnh viêm gan vịt do virus ở một số
tỉnh đồng bằng Bắc Bộ. Phân lập virus gây bệnh, nghiên cứu đặc tính sinh học của chủng virus viêm gan vịt nhược độc DH - EG - 2000 và quy trình sản xuất vacxin. Luận văn thạc sỹ nông nghiệp. Trường Đại học nông nghiệp I.
9. Nguyễn Thát (1975). Bệnh gia cầm. NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội
10. Nguyễn Văn Cảm, Nguyễn Thị Thu Hà và Nguyễn Khánh Ly (2001). Nghiên
cứu biến đổi bệnh lý bệnh viêm gan virus vịt. Khoa học và kỹ thuật Thú y, 8(4), Hội thú y Việt Nam, tr. 48-51.
12. TCVN 8685-2:2011. Quy trình kiểm nghiệm vacxin-phần II: Vacxin viêm gan siêu vi trùng vịt
13. Trần Minh Châu và Lê Thu Hồng (1985). Thăm dò tạo chủng vacxin nhược độc
Viêm gan vịt bằng chủng virus phân lập tại địa phương. Tạp chí KHKT Thú y, Tập 4 (3-1985), tr.3-8
14. Trần Thị Lan Hương, Phạm Thị Hường, Nguyễn Bá Hiên (2008). Ảnh hường
của miễn dịch thụ động viêm gan vịt đến đáp ứng miễn dịch củ vịt con khi tiêm liều vacxin đầu tiên. Tạp chí Khoa học và phát triển, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, 6(4), tr. 338-342.
15. Vũ Triệu An (1997). Miễn dịch học. NXB Y học. Hà Nội
Tiếng Anh
16. Adamiker D. (1969). Elektronenmikros kopiscle untersuchungen zus
virushepatitis der Etenkken, Zentrabl Veterianezmed [B] 16: 620-636.
17. Adamiker D. (1970). Die Virushepatitis der Entenkken im
elektronenmikroskopischen Bild, Teil II: Befunde an der Milz und am Muskei. Zentralbl Veterinaermed [B] 17: 880-889
18. Aspin F.D (1958), An attenuated strain ò duck hepatitis virus , Vet Rec 70, pp.
1226-1230
19. Asplin F.D (1961). Notes on epidemiology and wacination for virus hepatitis of
ducks. Epizôt bull 56,pp.793-800
20. Asplin F.D (1970). Examination of sera from wild fowl for antibodies against the
viruses of duck plague duck hepatitis and duck influenza, Vet Rec 87, pp. 182-183.
21. Asplin, F.D. (1965). Duck hepatitis: Vaccination against two serological types,
Veterinary Record, 87, pp. 182-183.
22. Ding C and Zhang D (2007). Molecular analysis of duck hepatitis virus type 1,
Virology 361, pp. 9-17.
23. Fabricant J and Levine P.P (2002). Duck virus hepatitis, Diseases of Poultry, (9th
Ed), Lowa State University Press, Ames, Lowa, U.S.A.
24. Fabricant J, Rickard C.G and Levine P.P (1957). The pathology of duck virus
hepatitis, Avian Diseases, pp. 256-275.
25. Ghazi F, Hughes P.J, Hyypiä T and Stanway G (1998). Molecular analysis of
26. Golubnichi V.P. and G.V. Malinovskaya (1984). Dynamics of postvaccinal antibodies in blood serum against duck hepatitis virus, Vet Nauk Proiz (Minsk) 22, pp. 72-75. (Abstr Agro Salekt 1985: 1973).
27. Gough R.E and Spackman D (1981). Studies with inactivated duck virus
hepatitis vacxins in breeder ducks, Avian Pathol 10, pp. 471-479.
28. Haider S.A. and B.W. Calnek (1979). “In vitro isolation, propagation and
characterization of duck hepatitis virus type III” Avian disease, 23, pp. 715-729.
29. Hwang, J. (1973). Active immunization against duck hepatitis virus. Amj Vet
Res 33, pp. 2539-2544.
30. enkins K.A, Bean A.G and Lowenthal J.W (2007). Avian genomics and the
innate immune response to viruses, Cytogenet Genome Res 117, pp. 207-212.
31. Jenkins K.A, Bean A.G and Lowenthal J.W (2007). Avian genomics and the