3.3.6.1. Phương pháp tách chiết ARN tổng số
Tách chiết ARN tổng số bằng phương pháp Accuzol như sau:
- Thêm 750 µl dung dịch Accuzol vào ống Eppendorf. Bổ sung 250 µl dịch nước trứng và 200 µl chloroform. Vortex 15 giây.
- Ủ đá 5 phút. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút, loại bỏ phần dung dịch phía dưới. Chuyển toàn bộ hỗn dịch trên sang ống Eppendorf 1,5 ml mới.
- Thêm dung dịch Isopropanol (100%) theo tỷ lệ 1:1. - Ủ hỗn dịch ở (-200C) trong 10 phút.
- Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ toàn bộ dịch phía trên, thu giữ tủa trắng ở đáy ống Eppendorf.
- Thêm 1000 µl dịch Ethanol (800), vortex mẫu.
- Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ toàn bộ dịch phía trên, thu giữ tủa trắng ở đáy ống Eppendorf.
- Làm khô mẫu trong tủ an toàn sinh học.
- Thêm 30 µl nước đặc biệt tinh khiết đã làm ấm ở (370C) để làm tan mẫu. Ghi kí hiệu mẫu và bảo quản ở - 200C cho đến khi sử dụng.
Bước 3: Thêm 500 µl dung dịch WB, ly tâm 13.000vòng/phút trong 1 phút, đổ bỏ dịch dưới, ly tâm lại thêm một lần nữa để làm khô màng.
Bước 4: Chuyển cột sang ống Eppendorf mới, thêm 30 µl dung dịch EL vào chính giữa màng lọc, để ở nhiệt độ phòng 2 phút, ly tâm 13.000vòng/phút trong 1 phút, thu sản phẩm PCR đã được tinh sạch. Ký hiệu mẫu và bảo quản ở - 200C cho đến khi sử dụng.
3.3.6.2. Phương pháp tách chiết và tinh sạch ARN hệ gen
ARN hệ gen của virus được tách chiết và tinh sạch sử dụng bộ kit QIAamp ARN Viral kit; của Hãng QIAGEN theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Đo hàm lượng ARN bằng quang phổ kế (spectrophotometer), hoặc xác định trên thạch agarose.
3.3.6.3. Phương pháp thiết kế mồi đặc hiệu
Mồi đặc hiệu của từng gen đối tượng được thiết kế trên cơ sở chuỗi gen đã có trong Ngân hàng gen.
Danh sách các mồi dùng cho phản ứng PCR/RT-PCR trong nghiên cứu virus Viêm gan vịt
Tên mồi Trình tự chuỗi mồi (5’ → 3’) Nồng độ
sử dụng Độ dài của sản phẩm thu được DH3F 5’- GCCCCACTCTATGGAAATTTG -3’ 10pM VP1: 0,8 kb DH4R 5’ ATTTGGTCAGATTCAATTTCC 3’ 10pM DHAV3F 5’-ATGCGAGTTGGTAAGGATTTTCAG-3’ 10pM DHAV3R 5’-GATCCTGATTTACCAACAACCAT-3’ 10pM
3.3.6.4. Phương pháp RT- PCR và phân tích kiểm tra gen kháng nguyên của virus giống
Sử dụng phương pháp RT-PCR một bước (one-step RT-PCR) của Hãng QIAGEN, để thu nhận sản phẩm VP1 của virus viêm gan vịt.
* Phản ứng RT - PCR
Phản ứng RT-PCR thực chất là phản ứng nhân một đoạn giới hạn của khuôn ARN, theo nguyên lý của phản ứng PCR, bao gồm hai giai đoạn: Giai đoạn thứ nhất là chuyển đổi một sợi ARN làm khuôn thành ADN 2 sợi, sau đó qua giai đoạn thứ hai, dùng ADN 2 sợi này tiếp tục làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR như đã giới thiệu ở mục trên.
Phản ứng RT: là giai đoạn chuyển ARN hệ gen thành ADN nhờ enzym sao chép ngược biến ARN hệ gen ở dạng sợi đơn sang dạng sợi kép ADN bằng cách thực hiện phản ứng ở nhiệt độ 550C trong vòng 30 phút.
Phản ứng PCR: Đó là giai đoạn gồm 3 bước như đã giới thiệu. - Cách tiến hành phản ứng RT-PCR
Giai đoạn 1 (RT: 1 chu kỳ) Thực hiện sao chép ngược từ ARN sợi đơn sang ADN sợi kép: 550C 30 phút
Giai đoạn 2 (PCR): Gồm các bước
+ Bước khởi đầu (1 chu kỳ): Bung kiên kết: Bung chuỗi xoắn kép ADN 2 sợi thành ADN 1 sợi làm khuôn và cho mồi bám vào: 940-950C/15 phút.
+ Bước 1: Bung liên kết, bung chuỗi xoắn kép ADN 2 sợi thành ADN 1 sợi làm khuôn và cho primer bám vào 940-950C/1 phút.
+ Bước 2: Bám mồi: thực hiện ở 610C trong 1 phút để gắn mồi. + Bước 3: Tổng hợp ADN kéo dài (nhân ADN) ở 720C/1 phút. (Các bước 1, 2, 3 được thực hiện lặp đi lặp lại trong 35-40 chu kỳ).
+ Bước kết thúc: (1 chu kỳ) Hoàn chỉnh đoạn gen cho ADN sản phẩm: 720C/5-10 phút.