2.2.9.1. Vắc xin phòng bệnh
Nguyên lý của việc tiêm phòng bằng vacxin là gây ra trong cơ thể sống một đáp ứng chủ động của hệ thống miễn dịch nhằm tạo ra kháng thể dịch thể hay tế bào chống lại những nhóm quyết định kháng nguyên của yếu tố có khả năng gây bệnh và nhờ đó làm mất khả năng này. Biện pháp tiêm phòng bằng vắc xin đã mang lại cho y học, thú y học những thành tựu lớn trong phòng bệnh do virus và vi khuẩn gây ra.
Gần đây, do sự hiểu biết về lý thuyết miễn dịch, sự không ngừng cải tiến trong kỹ thuật chẩn đoán, sự phát triển liên tục của những sản phẩm mới và phương thức sử dụng vacxin mới đã làm cho việc phòng bệnh bằng vắc xin được giải quyết một cách hoàn thiện.
Vắc xin phòng bệnh viêm gan vịt có 2 loại: vắc xin nhược độc và vắc xin vô hoạt.
- Vắc xin nhược độc: Virus cường độc dưới tác động của các yếu tố sinh học: tiêm truyền nhiều lần qua động vật ít cảm thụ, qua phôi, thì độc lực của virus giảm đi. Virus vẫn có khả năng nhân lên trong cơ thể vật chủ nhưng không gây bệnh nên được dùng để làm vắc xin. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy các chủng virus viêm gan vịt cường độc sau khi đã cấy truyền qua phôi gà không còn khả năng gây bệnh cho vịt con nhưng virus vẫn nhân lên trong tế bào các mô, so với chủng virus viêm gan vịt cường độc thì mức độ nhân lên của virus này là thấp hơn (Hwang, 1965).
Bằng phương pháp giảm độc trên phôi đã tạo ra nhiều chủng virus viêm gan vịt nhược độc. Hiện nay, vắc xin viêm gan vịt nhược độc dùng chủ yếu ở Châu Âu là loại đã được giảm độc sau 53 - 55 lần tiếp truyền qua phôi gà 8 -10 ngày tuổi; ở Mỹ là loại giảm độc sau 84 - 89 lần cấy truyền. Vắc xin được bảo quản ở nhiệt độ âm 700C trong vài năm.
- Vắc xin vô hoạt: Ngoài vắc xin nhược độc còn có vắc xin vô hoạt. Vắc xin viêm gan vịt vô hoạt được sản xuất từ virus viêm gan vịt bằng cách nuôi cấy virus trên phôi gà, thu hoạch dịch phôi, vô hoạt virus bằng BEI (Binary Ethylenimine), dùng bổ trợ dạng nhũ dầu (ES - STA (Lipid Emulsion System - Salmonella typhimurium) và có lympho B phân bào (Woolcok, 1991). Bảo quản ở 40C trong thời gian 20 tháng vẫn giữ được hiệu lực của vắc xin.
Nghiên cứu hiệu lực của vắc xin viêm gan vịt vô hoạt, các tác giả đều cho biết vắc xin có khả năng tạo miễn dịch cao cho đàn vịt (Gough, 1981). Sử dụng 3 lần vắc xin vô hoạt nhũ dầu cho đàn vịt giống sẽ tạo được miễn dịch thụ động cho đàn vịt con. Hiện nay, trên thế giới mới có vắc xin viêm gan vịt nhược độc và vô hoạt serotype 1.
Trên thị trường Việt Nam đang sử dụng rộng rãi nhiều loại vắc xin nhược độc viêm gan vịt do các công ty Vetvaco, Navetco, Marphavet và RTD sản xuất đang dần dần thay thế vắc xin ngoại trong việc phòng chống bệnh.
Qua khảo sát sinh học phân tử hệ gen bước đầu cho thấy, chủng virus được sử dụng làm vắc xin có nguồn gốc từ Hàn Quốc, Ai Cập, Mỹ, Trung Quốc... Ngoài ra, một chủng virus vắc xin nhược độc khác của Học viện Nông nghiệp Việt Nam cũng đã được nghiên cứu đầy đủ về đặc tính sinh học (Nguyễn Phục Hưng, 2004; Nguyễn Bá Hiên, 2007), Quy trình sản xuất (Bùi Thanh Khiết, 2007; Nguyễn Bá Hiên, 2007), đặc tính phân tử và đã bước đầu được ứng dụng vào thực tế. Kết quả nghiên cứu về sinh học phân tử cho thấy các loại vắc xin sử dụng tại Việt Nam đều thuộc genotype 1.
2.2.9.2. Chế phẩm sinh học phòng bệnh
Kháng thể phòng chống virus viêm gan vịt chiết xuất từ lòng đỏ trứng gà với công nghệ tinh chế cao, hiệu lực mạnh, phổ kháng virus rộng và thời gian bảo vệ kéo dài.
Sử dụng công nghệ tinh chế tiên tiến, loại bỏ phần lớn Lecithin, chất béo, protein thô, những chất này chiếm thể tích lớn mà không có tác dụng điều trị, có thể gây stress và các phản ứng dị ứng. Protein kháng thể chiết xuất hoàn toàn làm cho kháng thể được hấp thu nhanh chóng sau khi tiêm, nhanh chóng phát huy tác dụng. Nếu sử dụng ngay từ giai đoạn đầu và giữa của bệnh, sản phẩm có thể phát huy tác dụng ngay lập tức và chỉ cần dùng một lần. Sản phẩm không chỉ dùng cho các chủng thông thường mà còn được dùng cho các chủng vịt nhiễm virus nặng ở các khu vực dịch nặng.
Khoảng thời gian bảo vệ kéo dài, kháng thể tồn tại được 14 ngày trong máu sau khi tiêm và thời gian kháng virus hiệu quả cao hơn 10 ngày, vì vậy 1 lần tiêm có thể bảo vệ vịt khỏi bệnh trong 14 ngày, tỷ lệ phòng bệnh hiệu quả là 100% và tỷ lệ chữa khỏi bệnh hơn 95%.
Sản phẩm an toàn, không độc, không tồn dư, không gây ô nhiễm và không ảnh hưởng đến chất lượng thịt.
PHẦN 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Giống virus Viêm gan vịt cường độc.
3.1.2. Nguyên liệu, hóa chất nghiên cứu
- Vắc xin viêm gan vịt - Trứng vịt có tinh.
- Trứng gà Leghorn có phôi đã ấp được 9 ngày - Vịt xiêm 1 - 3 ngày tuổi đạt tiêu chuẩn thí nghiệm. - Môi trường nuôi cấy tế bào Eagle MEM.
- Trypsin, Phenol red, NaHCO3, Na2HPO4,... Các chất dùng để tách ARN của virus: - Nito lỏng
- Trizol (Life Technologies): 1ml
- Men sao chép ngược: Reverse Transcriptase. - SDS 0,5%...
- Bộ kit tách chiết RNA tổng số, “QIAamp Viral Mini kit (QIAGEN Inc, USA)” và hoá chất do hãng QIAGEN cung cấp.
- Bộ kit dùng cho phản ứng RT-PCR do hãng Invitrogen cung cấp. - Bộ kit dùng cho phản ứng chuyển đổi cDNA hãng Fermentas cung cấp.
- Bộ kit dùng cho phản ứng PCR do hãng Fermentas cung cấp.
- Bộ kit dùng để tinh sạch sản phẩm PCR/RT-PCR do hãng QIAGEN và BIOONER cung cấp.
- Bộ kit dùng để tách DNA từ thạch agarose ”MinElute Gel Extraction Kit” do hãng QIAGEN cung cấp.
- Bộ kit tách dòng “TA-cloning kit” do hãng Invitrogen cung cấp. - Kháng sinh kanamycin, ampicilin (50 mg/ml), X-gal, cồn tuyệt đối.
- Bộ kit tách DNA plasmid tái tổ hợp, “QIAprep Spin Miniprep Kit” do hãng QIAGEN cung cấp.
- Bộ kit dùng cho phản ứng PCR giải trình tự.
- Bộ kit dùng để tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự. - Các dung dịch sử dụng trong tách dòng.
- Các dung dịch dùng để điện di trên thạch agarose
Các chất tham gia phản ứng PCR có trong bộ Kit của Hãng Qiagen:
- RT Buffer. - RNase inhibitor
- AMV-RT (enzym sao chép ngược) - 25 mM MgCl2.
- Taq DNA polymerase - DNA Marker.
3.1.3. Thiết bị, máy móc
- Các loại máy móc bao gồm: Tủ lạnh thường, tủ lạnh âm sâu -800C (Sanyo), tủ ấm 370C (Sanyo), Máy ly tốc độ cao, máy ly tâm lạnh, Máy PCR (PTC-100 thermal cycler) của MJ. Research Inc. (Mỹ), Máy điện di kiểm tra sản phẩm PCR/RT-PCR của hãng Fermentas và Bio-Rad, Máy soi gel Dolphin-Doc (Wealtech, Mỹ), kèm theo máy vi tính, Máy ổn nhiệt, máy nuôi lắc tế bào, máy Vortex, Laminair cấy vô trùng, Máy giải trình tự tự động ABI Avant Genetic Analyzer 3100, Máy giải trình tự tự động Applied Bionsystems (ABI) Model 3730XL, Bộ pipetman (10µl, 20µl, 100µl, 200µl, 1000µl và 5000µl), Máy tính và các phần mềm sinh - tin học.
- Các dụng cụ rẻ tiền mau hỏng: dao, kéo, panh, kẹp, phiến kính, đĩa Petri, các loại Eppendorf, các loại đầu côn, lọ đựng môi trường...
3.1.4. Địa điểm nghiên cứu
- Phòng Virus – Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y Trung ương I.
- Khu thí nghiệm động vật của Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y Trung ương I.
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.2.1. Xác định đặc tính sinh học của giống virus Viêm gan vịt cường độc
(gồm các bước cấy truyền, khả năng gây nhiễm trên tế bào, độc lực, tính ổn định, tính kháng nguyên của giống); Giải mã gen đặc trưng xây dựng dữ liệu sinh học phân tử của giống.
- Tiếp truyền giống trên bản động vật - Khảo sát đặc tính sinh học gồm các bước: + Kiểm tra vô trùng
+ Kiểm tra tính thuần khiết + Nhận dạng
+ Kiểm tra độc lực: EID50, xác định các chỉ số sinh học trên phôi gà. - Giải mã cấu trúc và trình tự gen của virus Viêm gan vịt cường độc. - Đông khô và lưu giữ giống
3.2.2. Ứng dụng chủng virus Viêm gan vịt cường độc để kiểm nghiệm vắc xin Viêm gan vịt nhược độc Viêm gan vịt nhược độc
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1. Phương pháp kiểm tra vô trùng của giống
Giống virus được kiểm tra vô trùng theo TCVN 8684:2011 “Phương pháp kiểm tra thuần khiết”.
Giống virus đông khô, được hoàn nguyên trở lại bằng nước muối sinh lý hoặc dung dịch PBS pH 7,2 vô trùng.
môi trường) vào 5 loại môi trường: Thạch máu, thạch nấm, thạch thường, nước thịt và nước thịt gan yếm khí, mỗi loại 2 ống.
Môi trường đã cấy kiểm tra được theo dõi 7 ngày ở 370C. Riêng môi trường nấm để ở nhiệt độ phòng (25 – 300C).
3.3.2. Phương pháp kiểm tra độ thuần khiết của giống
3.3.2.1. Kiểm tra tạp nhiễm Mycoplasma
Tiến hành: Giống được cấy kiểm tra trên môi trường canh thang PPLO với nồng độ từ 1-2% giống đã pha loãng trong 100 ml môi trường và trên đĩa thạch PPLO có bổ sung huyết thanh ngựa và chất chiết nấm men với thể tích 0,1 ml kháng thể trên 1 đĩa.
Theo dõi môi trường lỏng trong 14 ngày ở nhiệt độ từ 33-370C. Tại các thời điểm 3 ngày, 7 ngày, 10 ngày, 14 ngày lấy canh khuẩn ở môi trường lỏng trên ria cấy vào môi trường thạch PPLO (2 đĩa). Ủ trong tủ ấm CO2 ở 370C có 5% khí CO2, theo dõi trong 28 ngày. Kết quả: Mẫu giống được xem là đạt khi không có khuẩn lạc Mycoplasma mọc trên môi trường kiểm tra.
3.3.2.2. Kiểm tra tạp nhiễm Salmonella
- Tiến hành nuôi cấy: Mẫu giống đã pha được cấy trên môi trường kiểm tra, dùng một trong các loại môi trường sau: Thạch MacConkey, thạch Salmonella- Shigella, với nồng độ từ 1-2% dung tích môi trường kiểm tra.
Ủ môi trường đã cấy giống trong tủ ở 370C, theo dõi từ 18h-24h sau đó cấy chuyển tiếp sang ống môi trường nước, dùng một trong các loại môi trường sau: Canh thang selenit hoặc canh thang tetrathionat. Ủ trong tủ ở 370C, theo dõi 48h- 72h. Giống được xem là đạt khi không có vi khuẩn Salmonella mọc trên các loại môi trường kiểm tra.
3.3.3. Phương pháp thu nhận bảo quản mẫu, tiếp truyền virus giống
- Mẫu virus được tiếp truyền liên tiếp 3 lần trên vịt.
- Mẫu sau khi thu hoạch được đông khô hoặc dạng tươi, bảo quản ở -700C để khảo sát sinh học phân tử và tính ổn định.
3.3.4. Phương pháp nuôi cấy tế bào xơ phôi gà một lớp
Tiến hành theo các bước sau:
- Soi để chọn những quả có phôi sống, khoẻ.
- Giết chết phôi bằng nhiệt lạnh để làm co mạch máu, sát trùng vỏ trứng, mổ trứng, gắp phôi ra đĩa Petri.
- Rửa phôi 3 lần bằng PBS.
- Cắt nhỏ phôi và rửa trên máy khuấy từ 2 lần. - Rửa tiếp bằng dung dịch Trypsin 0,125%. - Hút bỏ phần nước trong ở trên.
- Tiêu hoá tế bào bằng dung dịch Trypsin 0,25% trên máy khuấy từ trong phòng ấm 370C từ 30 – 60 phút.
- Lọc tế bào qua lưới lọc và ly tâm lạnh với tốc độ 2000 vòng/phút. - Chắt bỏ nước trong, dùng môi trường phát triển để pha loãng tế bào. - Đếm tế bào trên buồng đếm hồng cầu, định lượng tế bào.
- Pha tế bào thành nồng độ 0,5% (tương đương 75x104 tế bào/ml), chia tế bào ra các chai nuôi hoặc đĩa nhựa đáy phẳng 96 giếng và đặt nuôi trong phòng ấm 370C.
- Hàng ngày quan sát sự phát triển của tế bào xơ phôi gà trong các chai tế bào bằng kính hiển vi soi ngược.
3.3.5. Phương pháp xác định liều gây chết 50% vịt thí nghiệm
* Chuẩn bị chuồng trại: 10 ô chuồng được chuẩn bị, có lưới chống chuột, máng ăn, máng uống đã vệ sinh tiêu độc 1 tuần trước khi nhập vịt.
* Chuẩn bị vịt: Vịt xiêm 1-3 ngày tuổi, có nguồn gốc từ đàn vịt bố mẹ sạch bệnh, chưa sử dụng vắc xin Viêm gan vịt (giống virus Viêm gan vịt cường độc), được chia thành 10 lô, mỗi lô 5 con, 9 lô thí nghiệm và 1 lô đối chứng. Nuôi vịt chăm sóc chu đáo hàng ngày.
* Chuẩn bị giống virus: Giống virus được bảo quản ở nhiệt độ (-800C). Giống đông khô có hình thái đẹp, không vỡ vụn, màu vàng trắng. Hoàn nguyên 2 ống giống đông khô 1ml PBS pH 7,2 vô trùng, lắc nhẹ. Thêm vào huyễn dịch trên 4ml PBS pH 7,2 độ pha loãng 10-1, lắc nhẹ. Hòa tiếp 1ml giống pha loãng 10-1 với 9ml PBS, ta có độ pha loãng giống là 10-2, cứ thế ta có độ pha loãng 10-3; 10-4; 10-5;10-6; 10-7; 10-8 ;10-9.
* Gây bệnh cho vịt: Tiêm bắp cho mỗi vịt 1ml huyễn dịch virus pha loãng ở các nồng độ 10-1; 10-2; 10-3; 10-4; 10-5;10-6; 10-7; 10-8 ;10-9, mỗi nồng độ tiêm cho 5 vịt. Sau đó theo dõi và ghi lại số vịt sống và chết trong vòng 5 ngày, mổ kiểm tra bệnh tích vịt chết ở từng nồng độ tiêm và tính LD50 theo phương pháp Reed-Muench.
Log LD50 = Log A + X1 log f = Log B + X2 log f 50-A’ 50-B’ X1 = X2 = A’-B’ A’- B’ Trong đó: A: Số mũ nồng độ gây chết cận trên 50% B: Số mũ nồng độ gây chết cận dưới 50% A’: Tỷ lệ %> 50% B’: Tỷ lệ %<50%
Logf: Hệ số pha loãng virus
3.3.6. Phương pháp giải trình tự gen của virus
3.3.6.1. Phương pháp tách chiết ARN tổng số
Tách chiết ARN tổng số bằng phương pháp Accuzol như sau:
- Thêm 750 µl dung dịch Accuzol vào ống Eppendorf. Bổ sung 250 µl dịch nước trứng và 200 µl chloroform. Vortex 15 giây.
- Ủ đá 5 phút. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút, loại bỏ phần dung dịch phía dưới. Chuyển toàn bộ hỗn dịch trên sang ống Eppendorf 1,5 ml mới.
- Thêm dung dịch Isopropanol (100%) theo tỷ lệ 1:1. - Ủ hỗn dịch ở (-200C) trong 10 phút.
- Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ toàn bộ dịch phía trên, thu giữ tủa trắng ở đáy ống Eppendorf.
- Thêm 1000 µl dịch Ethanol (800), vortex mẫu.
- Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ toàn bộ dịch phía trên, thu giữ tủa trắng ở đáy ống Eppendorf.
- Làm khô mẫu trong tủ an toàn sinh học.
- Thêm 30 µl nước đặc biệt tinh khiết đã làm ấm ở (370C) để làm tan mẫu. Ghi kí hiệu mẫu và bảo quản ở - 200C cho đến khi sử dụng.
Bước 3: Thêm 500 µl dung dịch WB, ly tâm 13.000vòng/phút trong 1 phút, đổ bỏ dịch dưới, ly tâm lại thêm một lần nữa để làm khô màng.
Bước 4: Chuyển cột sang ống Eppendorf mới, thêm 30 µl dung dịch EL vào chính giữa màng lọc, để ở nhiệt độ phòng 2 phút, ly tâm 13.000vòng/phút trong 1 phút, thu sản phẩm PCR đã được tinh sạch. Ký hiệu mẫu và bảo quản ở - 200C cho đến khi sử dụng.
3.3.6.2. Phương pháp tách chiết và tinh sạch ARN hệ gen
ARN hệ gen của virus được tách chiết và tinh sạch sử dụng bộ kit QIAamp ARN Viral kit; của Hãng QIAGEN theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Đo hàm lượng ARN bằng quang phổ kế (spectrophotometer), hoặc xác định trên thạch agarose.
3.3.6.3. Phương pháp thiết kế mồi đặc hiệu
Mồi đặc hiệu của từng gen đối tượng được thiết kế trên cơ sở chuỗi gen đã