Neoscytalidium dimidiatum trong phòng thí nghiệm
Chúng tôi tiến hành khảo sát hiệu lực ức chế của nấm đối kháng với nấm
Neoscytalidium dimidiatum. Thí nghiệm gồm 4 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 01 hộp petri.
CT1: Cấy riêng nấm đối kháng và Neoscytalidium dimidiatum
CT2: Cấy nấm đối kháng trước Neoscytalidium dimidiatum 24 giờ
CT3: Cấy nấm đối kháng sau Neoscytalidium dimidiatum 24 giờ
CT4: Cấy nấm đối kháng và Neoscytalidium dimidiatum đồng thời
Phương pháp tiến hành:
+ Đối với công thức 2, 3, 4: dùng đột đã được khử trùng đột lấy phần đỉnh sinh trưởng của sợi nấm trên nguồn nấm thuần, sau đó tiến hành cấy chuyển, khoảng cách giữa miếng thạch và mép đĩa khoảng 1,5 cm, cấy một miếng thạch của nấm còn lại cấy ở phía đối diện của đĩa petri.
+ Công thức đối chứng: đặt miếng thạch chứa đỉnh sinh trưởng của sợi nấm vào giữa đĩa petri chưa môi trường PDA.
Chỉ tiêu theo dõi: Đo đường kính tản nấm đối kháng và nấm
Neoscytalidium dimidiatum sau 1-5 ngày nuôi cấy.
Tính hiệu lực đối kháng (%) theo công thức Abbott C-T
H (%) = --- x 100 C
Trong đó:
H: Là hiệu lực ức chế của nấm đối kháng
C: Đường kính tản nấm ở công thức đối chứng (không xử lý) T: Đường kính tản nấm ở công thức xử lý.
3.5.3.1. Khảo sát hiệu lực ức chế của các hoạt chất sinh học được tiết ra trong quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm đối kháng đã lựa chọn
Chúng tôi tiến hành khảo sát hiệu lực ức chế của hoạt chất sinh học được tiết ra trong quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm đối kháng với nấm
Neoscytalidium dimidiatum. Thí nghiệm gồm 4 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 01 hộp petri.
CT1: Đối chứng - Cấy nấm N. dimidiatum trên môi trường PDA
CT2: Cấy nấm N.dimidiatum trên môi trường chứa 90% PDA + 10% dd
nấm đối kháng
CT3: Cấy nấm N.dimidiatum trên môi trường chứa 70% PDA + 30% dd
nấm đối kháng
CT4: Cấy nấm N.dimidiatum trên môi trường chứa 50% PDA + 50% dd
nấm đối kháng
Phương pháp tiến hành:
- Nấm đối kháng được nuôi cấy trên môi trường thích hợp dạng lỏng cho từng loài, ở nhiệt độ, thời gian tối ưu đã nghiên cứu với tốc độ lắc ở 120 rpm.
- Dịch nuôi được tách ra từ dung dịch nhân nuôi và được đong thể tích. - Pha môi trường PDA và dịch nuôi nấm theo tỷ lệ các công thức thí nghiệm. - Đặt miếng thạch chứa đỉnh sinh trưởng của sợi nấm bệnh vào giữa đĩa petri tương ứng từng công thức.
Chỉ tiêu theo dõi: Đo đường kính tản nấm Neoscytalidium dimidiatum sau 1-5 ngày nuôi cấy.
3.5.3.2. Nghiên cứu quy trình tách chiết và lựa chọn dung môi để tách chiết các hoạt chất sinh học được tiết ra trong quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm đối kháng đã lựa chọn
* Nghiên cứu và lựa chọn dung môi tách chiết để thu các loại hoạt chất sinh học được sản sinh trong quá trình nhân nuôi
Dung môi được lựa chọn để áp dụng trong kỹ thuật tách chiết: + Dung môi: n – Hexane
+ Dung môi: Ethyl acetate (EtOAc)
+ Dung môi: n – Butanol và một số dung môi khác.
* Nghiên cứu quy trình kỹ thuật tách chiết các hợp chất sinh học từ nấm đối kháng đã lựa chọn
- Phương pháp tách chiết các hoạt chất sinh học được nấm đối kháng tiết ra trong môi trường nuôi cấy thu hoạt chất sinh học
Phương pháp được thực hiện theo Kanokmedhakul etal. (2006). Nấm đối
kháng được nuôi cấy trên môi trường thích hợp dạng lỏng cho từng loài, ở nhiệt độ, thời gian tối ưu đã nghiên cứu ở trên với tốc độ lắc ở 120 rpm.
Hình 3.1. Nấm đối kháng Trichoderma asperellum đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng thích hợp dạng lỏng ở tốc độ lắc 120rpm
Dịch nuôi được tách ra từ dung dịch nhân nuôi và được đong thể tích.
Quy trình tách chiết bằng dung môi n – Hexane:
- Cho 500ml dịch nuôi vào phễu chiết. Thêm 300ml dung môi n – Hexane
vào phễu chiết và lắc đều hỗn hợp trên sau đó cố định phễu chiết lên giá đỡ. Chờ hỗn hợp lắng xuống và phân thành 3 lớp (Hình 3.2.).
- Dùng cốc đo thủy tinh (Cốc thủy tinh 1) tách lấy dd ở lớp dưới cùng qua van. Lắc đều hỗn hợp còn lại trong phễu chiết và tiếp tục để lắng lần thứ 2.
- Dung dịch phân thành 3 lớp, tiếp tục tách lớp dung dịch dưới cùng qua van vào cốc thủy tinh 1.
- Lắc đều hỗn hợp còn lại trong phễu chiết và để lắng lần 3.
- Tách hết lớp dung dịch cuối cùng và thứ 2 qua van vào cốc thủy tinh 1. Tách riêng lớp dung môi trên cùng có hòa tan hoạt chất sinh học của nấm ra riêng một bình tam giác có nắp giấy bạc - dịch chiết từ dung môi n – Hexane.
- Làm tương tự các bước trên tách chiết dịch nấm ở cốc thủy tinh 1 trên thêm 2 lần với dung môi n – Hexane (mỗi lần sau dùng khoảng 200ml n – Hexane).
Hình 3.2. Phễu tách chiết hoạt chất sinh học do nấm đối kháng Trichoderma
asperellum tiết ra bằng dung môi
- Dịch nuôi nấm được hòa cùng từng loại dung môi và hoạt chất sinh học
sẽ hòa tan trong các loại dung môi này. Thu tách lớp dung môi đó và tiến hành cho bay hơi, cô đặc chúng ta được sản phẩm chiết thô – hợp chất sinh học.
- Dịch chiết từ dung môi n – Hexane tiến hành cho bay hơi, cô đặc bằng chân không được sản phẩm chiết thô 1 (ký hiệu là H) (Hình 3.3.).
Hình 3.3. Tiến hành cho bay hơi, cô đặc bằng chân không dịch chiết từ các dung môi
- Dung dịch đã loại bỏ lớp dung môi n - Hexane được hòa tan với dung môi Ethyl acetate (EtOAc) và n - Butanol theo cách thức tương tự như đối với n - Hexane và tạo ra sản phẩm chiết thô 2 (ký hiệu là E) và 3 (ký hiệu B).
- Mỗi sản phẩm chiết thô được cân và giữ ở 5°C cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.5.3.3. Nghiên cứu đánh giá hiệu lực sinh học của các hợp chất sinh học thu được từ nấm đối kháng đối với nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long
Phương pháp nghiên cứu đánh giá hiệu lực sinh học của từng sản phẩm chiết thô – hợp chất sinh học với nấm Neoscytalidium dimidiatum
- Mỗi sản phẩm chiết sẽ được thử hoạt tính đối kháng ở các nồng độ 500,
1000 và 2000μg/ml. Mỗi sản phẩm chiết sẽ được hòa trong dung dịch Methanol (MeOH) 2 %.
- Nấm Neoscytalidium dimidiatum được nuôi cấy lỏng, dùng pipet hút dịch nuôi nấm bệnh cho vào môi trường PDA (đã hấp khử trùng, để nguội đến 40-50 0C) với tỷ lệ 0,5% lắc đều đổ ra các đĩa petri đã được vô trùng.
- Sau khi đĩa thạch chứa nấm bệnh đã khô bề mặt đánh dấu vị trí đặt 10
công thức thí nghiệm, gắp các đĩa giấy thấm đường kính 10mm đặt vào các vị trí, dùng micropipet nhỏ từng giọt dịch chiết nấm đối kháng tương ứng từng công thức thí nghiệm vào đĩa giấy thấm.
- Đặt đĩa thạch ở 28°C . Đường kính vòng đối kháng sẽ được đo ở 1, 2, 3 ngày.
Gồm các công thức sau: tiến hành riêng rẽ với từng chủng Chaetomium và
Trichoderma
+ CT1: N. dimidiatum – Dịch nuôi nấm T. asperellum không qua lọc.
+ CT2: N. dimidiatum – H (Sản phẩm chiết thô từ n – Hexane)
+ CT3: N. dimidiatum – E (Sản phẩm chiết thô từ Ethyl acetate - EtOAc)
+ CT4: N. dimidiatum – B (Sản phẩm chiết thô từ n – Butanol)