3.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
- Nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long.
- Nấm đối kháng Trichoderma asperellum, Trichoderma harzianum và
Chaetomium sp.
3.2. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Địa điểm nghiên cứu:
- Bộ môn Bệnh cây – Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
- Viện Di truyền nông nghiệp.
- Viện Hóa học cơng nghiệp Việt Nam.
Thời gian thực hiện đề tài: Từ tháng 3/2017 đến tháng 3/2018.
3.3. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 3.3.1. Thu thập mẫu, cây thí nghiệm 3.3.1. Thu thập mẫu, cây thí nghiệm
- Nguồn nấm gây bệnh được phân lập từ nấm bệnh đốm nâu thanh long
- Nguồn nấm đối kháng: nấm đối kháng Trichoderma asperellum và
Trichoderma harzianum được cung cấp bởi Bộ môn Bệnh cây – Học viện Nông
nghiệp Việt Nam. Nấm đối kháng Chaetomium sp. được cung cấp bởi Trung tâm nghiên cứu Bệnh cây Nhiệt đới – Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
3.3.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất nghiên cứu
* Dụng cụ
- Nồi hấp, tủ lạnh, buồng cấy nấm, kính hiển vi, cân điện tử, giá ni cấy nấm, xoong, tủ sấy.
- Các dụng cụ nhỏ: cân kỹ thuật, bình đựng nước, bình tam giác, đũa thủy tinh, bếp điện, vải màn lọc, hộp lồng petri, que cấy nấm. Đèn cồn, khay đựng, giấy ẩm, dao, kéo, panh, chậu nhựa, kính lúp, túi lấy mẫu các loại, giấy bạc, màng bọc thực phẩm...
* Hóa chất
- Agar, đường glucose, sucrose, khoai tây, cà rốt, nước cất vô trùng,... - Dung môi tách chiết hoạt chất sinh học:
+ Dung môi: Ethyl acetate (EtOAc)
+ Dung môi: n – Butanol và một số dung môi khác.
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.4.1. Trong phịng thí nghiệm 3.4.1. Trong phịng thí nghiệm
- Phân lập, nuôi cấy nấm bệnh Neoscytalidium dimidiatum trên mơi
trường PDA, WA, PCA từ đó quan sát đặc điểm hình thái: tản nấm, sợi nấm,...và đặc điểm sinh học của nấm bệnh.
- Nghiên cứu đặc tính sinh học nấm đối kháng Trichoderma
asperellum, Trichoderma harzianum và Chaetomium sp. đối với nấm Neoscytalidium dimidiatum.
Thử nghiệm hiệu lực ức chế của nấm Trichoderma và Chaetomium sp. đối với nấm gây bệnh đốm nâu thanh long Neoscytalidium dimidiatum.
- Nghiên cứu quy trình tách chiết và lựa chọn dung mơi để tách chiết các hoạt chất sinh học được tiết ra trong quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm
Chaetomium sp. và Trichoderma. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Nghiên cứu đánh giá hiệu lực sinh học của các hợp chất sinh học thu
được từ nấm đối kháng Chaetomium sp. và Trichoderma đối với nấm
Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh trên cây thanh long.
3.5. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Phƣơng pháp nghiên cứu trong phịng thí nghiệm * Chuẩn bị mơi trƣờng ni cấy
Đĩa petri, ống đong, ống nghiệm, bình tam giác, đũa thủy tinh được sấy khử trùng ở 140oC trong 2 giờ.
* Môi trƣờng WA (Water Agar medium)
Thành phần môi trường:
- Nước cất: 1000ml - Agar: 20g
Phương pháp điều chế: Agar được hòa tan trong nước đun sôi và hấp vô
trùng trong điều kiện 121oC (1,5atm) trong thời gian 45 phút. Môi trường sau khi
hấp xong để nguội dần khoảng 60oC rồi đổ vào các đĩa petri 5ml/đĩa với lượng môi
trường này thao tác cát một bào tử sẽ dễ dàng hơn. Môi trường này dùng để phân lập nấm ban đầu, ít bị lẫn tạp do nghèo dinh dưỡng và để nuôi cấy đơn bào tử.
* Môi trƣờng PDA (Potato D-Glucose Agar)
Đây là môi trường giàu dinh dưỡng dùng để nuôi cấy làm thuần nấm để quan sát các đặc điểm hình thái, màu sắc, đo kích thước sợi nấm, sắc tố tản nấm sinh ra trên môi trường là các chỉ tiêu để phân loại nấm.
Thành phần môi trường: - Khoai tây: 200g - Agar: 20g - Đường Glucose: 20g - Nước cất: 1000ml
Phương pháp điều chế: Chọn những củ khoai tây khơng bị bệnh, cịn
ngun vẹn, gọt sạch vỏ, cắt thành từng miếng nhỏ. Cho khoai tây trên vào nước cất với liều lượng đã định sẵn, đun sơi 15-20 phút, sau đó lọc sạch bằng vải màn, bỏ bã khoai tây, chỉ lấy dịch trong, bổ sung nước cất cho đủ liều lượng. Tiếp đó cho từ từ agar và đường glucose đã cân đủ lượng vào dịch khoai tây khuấy đều cho tan hết rồi đun sơi lại dịch khoai tây. Sau đó cho vào bình tam giác, phủ giấy bạc rồi khử trùng trong nồi hấp ở điều kiện 121oC (1.5atm) trong thời gian 45
phút. Sau khi hấp xong lấy ra để nguội môi trường đến nhiệt độ 60oC (để tránh
tạp khuẩn, cho thêm thuốc kháng sinh Penicillin hoặc Steptomycin với liều lượng 10mg/100ml). Sau đó lắc đều rồi đổ ra các đĩa Petri (đã được khử trùng và sấy khô từ trước). Lượng môi trường từ 10-15ml/đĩa Petri. Sau khi mơi trường đơng cứng có thể tiến hành phân lập và ni cấy nấm.
* Môi trƣờng PCA (Potato Carot Agar)
Thành phần: -Nước cất: 1000ml -Khoai tây: 100g - Cà rốt: 100g - Đường Glucose: 20g - Agar: 20g
Phương pháp điều chế: Chọn những củ khoai tây, cà rốt không bị bệnh,
còn nguyên vẹn, gọt sạch vỏ, cắt thành từng miếng nhỏ. Cho khoai tây và cà rốt trên vào nước cất với liều lượng đã định sẵn, đun sôi 15-20 phút, sau đó lọc sạch bằng vải màn, bỏ bã khoai tây, chỉ lấy dịch trong, bổ sung nước cất cho đủ liều
lượng. Tiếp đó cho từ từ agar và đường glucose đã cân đủ lượng vào dịch khoai tây, cà rốt khuấy đều cho tan hết rồi đun sơi lại dịch khoai tây, cà rốt. Sau đó cho vào bình tam giác, phủ giấy bạc rồi khử trùng trong nồi hấp ở điều kiện 121oC (1.5atm) trong thời gian 45 phút. Sau khi hấp xong lấy ra để nguội môi trường đến nhiệt độ 60o
C.
* Môi trƣờng PDB (Potato Dextrose Broth)
Thành phần:
- Nước cất: 1000 ml - Khoai tây: 200g - Đường glucose: 20g
Phương pháp điều chế: Chọn những củ khoai tây không bị bệnh, còn nguyên vẹn, gọt sạch vỏ, cắt thành từng miếng nhỏ. Cho khoai tây trên vào nước cất với liều lượng đã định sẵn, đun sơi 15-20 phút, sau đó lọc sạch bằng vải màn, bỏ bã khoai tây, chỉ lấy dịch trong, bổ sung nước cất cho đủ liều lượng. Tiếp đó cho từ từ đường glucose đã cân đủ lượng vào dịch khoai tây khuấy đều cho tan hết rồi đun sơi lại dịch khoai tây. Sau đó cho vào bình tam giác, phủ giấy bạc rồi (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
khử trùng trong nồi hấp ở điều kiện 121oC (1.5atm) trong thời gian 45 phút. Sau
khi hấp xong lấy ra để nguội môi trường đến nhiệt độ 30oC.
3.5.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm
3.5.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm
- Sử dụng nguồn nấm thuần. Cấy nấm vào giữa đĩa petri (chứa môi trường PGA) và đặt trong tủ định ôn được chỉnh ở các ngưỡng nhiệt độ: 15o
C, 20oC, 25oC, 30oC, 35oC. Mỗi ngưỡng nhiệt độ nhắc lại 3 lần (3 đĩa petri).
- Chỉ tiêu theo dõi: Đo đường kính tản nấm sau các ngày nuôi cấy
3.5.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm.
- Nguồn nấm thuần được cấy trên môi trường PDA và đặt ở các ngưỡng pH: 3, 4, 5, 6, 7, 8. Mỗi ngưỡng pH nhắc lại 3 lần (3 đĩa petri).
- Phương pháp tiến hành:
+ Chuẩn bị môi trường PDA chứa nồng độ pH: Chọn củ khoai tây sạch bệnh, rửa sạch, gọt vỏ, thái nhỏ cho vào nồi nước cất chứa 1000ml đun sôi, sau khi đun sôi được 20 phút thì lọc lấy phần nước qua phễu có màng lọc. Sau đó, đổ
pH, điều chỉnh nồng độ pH bằng cách nhỏ từ từ dung dịch NaOH và HCl vào dung dịch trên cho đến khi đạt được nồng độ pH cần thí nghiệm. Cho từ từ agar vào khuấy đều rồi cho đường glucose vào. Môi trường được cho vào bình tam
giác, đậy nút giấy bạc lại. Sau đó đem hấp khử trùng ở 121oC, 1.5 atm trong thời
gian 2 giờ, để nguội 60oC.
+ Dùng đột lấy một miếng thạch chứa đỉnh sinh trưởng của sợi nấm đặt vào giữa đĩa petri chứa môi trường PDA chứa các nồng độ pH.
- Chỉ tiêu theo dõi: Đo đường kính tản nấm sau các ngày nuôi cấy.
3.5.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến sự phát triển của nấm
- Nguồn nấm thuần được cấy trên các môi trường PDA, PCA, WA ở nhiệt độ phịng thí nghiệm. Mỗi mơi trường nhắc lại 3 lần (3 đĩa petri).
- Phương pháp tiến hành:
+ Chuẩn bị các môi trường PDA, PCA, WA (mục 3.5.1)
+ Dùng đột lấy một miếng thạch chứa đỉnh sinh trưởng của sợi nấm đặt vào giữa đĩa petri chứa môi trường PDA, PCA, WA.
3.5.3. Khảo sát hiệu lực ức chế của nấm đối kháng đối với nấm
Neoscytalidium dimidiatum trong phịng thí nghiệm
Chúng tôi tiến hành khảo sát hiệu lực ức chế của nấm đối kháng với nấm
Neoscytalidium dimidiatum. Thí nghiệm gồm 4 cơng thức, mỗi công thức 3 lần
nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 01 hộp petri.
CT1: Cấy riêng nấm đối kháng và Neoscytalidium dimidiatum CT2: Cấy nấm đối kháng trước Neoscytalidium dimidiatum 24 giờ CT3: Cấy nấm đối kháng sau Neoscytalidium dimidiatum 24 giờ CT4: Cấy nấm đối kháng và Neoscytalidium dimidiatum đồng thời Phương pháp tiến hành:
+ Đối với công thức 2, 3, 4: dùng đột đã được khử trùng đột lấy phần đỉnh sinh trưởng của sợi nấm trên nguồn nấm thuần, sau đó tiến hành cấy chuyển, khoảng cách giữa miếng thạch và mép đĩa khoảng 1,5 cm, cấy một miếng thạch của nấm cịn lại cấy ở phía đối diện của đĩa petri.
+ Cơng thức đối chứng: đặt miếng thạch chứa đỉnh sinh trưởng của sợi nấm vào giữa đĩa petri chưa môi trường PDA.
Chỉ tiêu theo dõi: Đo đường kính tản nấm đối kháng và nấm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Neoscytalidium dimidiatum sau 1-5 ngày ni cấy.
Tính hiệu lực đối kháng (%) theo công thức Abbott C-T
H (%) = ---------- x 100 C
Trong đó:
H: Là hiệu lực ức chế của nấm đối kháng
C: Đường kính tản nấm ở cơng thức đối chứng (khơng xử lý) T: Đường kính tản nấm ở công thức xử lý.
3.5.3.1. Khảo sát hiệu lực ức chế của các hoạt chất sinh học được tiết ra trong quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm đối kháng đã lựa chọn
Chúng tôi tiến hành khảo sát hiệu lực ức chế của hoạt chất sinh học được tiết ra trong quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm đối kháng với nấm
Neoscytalidium dimidiatum. Thí nghiệm gồm 4 công thức, mỗi công thức 3 lần
nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 01 hộp petri.
CT1: Đối chứng - Cấy nấm N. dimidiatum trên môi trường PDA
CT2: Cấy nấm N.dimidiatum trên môi trường chứa 90% PDA + 10% dd
nấm đối kháng
CT3: Cấy nấm N.dimidiatum trên môi trường chứa 70% PDA + 30% dd
nấm đối kháng
CT4: Cấy nấm N.dimidiatum trên môi trường chứa 50% PDA + 50% dd
nấm đối kháng
Phương pháp tiến hành:
- Nấm đối kháng được nuôi cấy trên môi trường thích hợp dạng lỏng cho từng lồi, ở nhiệt độ, thời gian tối ưu đã nghiên cứu với tốc độ lắc ở 120 rpm.
- Dịch nuôi được tách ra từ dung dịch nhân nuôi và được đong thể tích. - Pha mơi trường PDA và dịch ni nấm theo tỷ lệ các cơng thức thí nghiệm. - Đặt miếng thạch chứa đỉnh sinh trưởng của sợi nấm bệnh vào giữa đĩa petri tương ứng từng công thức.
Chỉ tiêu theo dõi: Đo đường kính tản nấm Neoscytalidium dimidiatum sau 1-5 ngày ni cấy.
3.5.3.2. Nghiên cứu quy trình tách chiết và lựa chọn dung môi để tách chiết các hoạt chất sinh học được tiết ra trong quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm đối kháng đã lựa chọn
* Nghiên cứu và lựa chọn dung môi tách chiết để thu các loại hoạt chất sinh học được sản sinh trong q trình nhân ni
Dung môi được lựa chọn để áp dụng trong kỹ thuật tách chiết: + Dung môi: n – Hexane
+ Dung môi: Ethyl acetate (EtOAc)
+ Dung môi: n – Butanol và một số dung môi khác.
* Nghiên cứu quy trình kỹ thuật tách chiết các hợp chất sinh học từ nấm đối kháng đã lựa chọn
- Phương pháp tách chiết các hoạt chất sinh học được nấm đối kháng tiết ra trong môi trường nuôi cấy thu hoạt chất sinh học
Phương pháp được thực hiện theo Kanokmedhakul et al. (2006). Nấm đối kháng được nuôi cấy trên mơi trường thích hợp dạng lỏng cho từng lồi, ở nhiệt độ, thời gian tối ưu đã nghiên cứu ở trên với tốc độ lắc ở 120 rpm.
Hình 3.1. Nấm đối kháng Trichoderma asperellum đƣợc ni cấy trên mơi trƣờng thích hợp dạng lỏng ở tốc độ lắc 120rpm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dịch nuôi được tách ra từ dung dịch nhân ni và được đong thể tích.
Quy trình tách chiết bằng dung mơi n – Hexane:
- Cho 500ml dịch nuôi vào phễu chiết. Thêm 300ml dung môi n – Hexane vào phễu chiết và lắc đều hỗn hợp trên sau đó cố định phễu chiết lên giá đỡ. Chờ hỗn hợp lắng xuống và phân thành 3 lớp (Hình 3.2.).
- Dùng cốc đo thủy tinh (Cốc thủy tinh 1) tách lấy dd ở lớp dưới cùng qua van. Lắc đều hỗn hợp còn lại trong phễu chiết và tiếp tục để lắng lần thứ 2.
- Dung dịch phân thành 3 lớp, tiếp tục tách lớp dung dịch dưới cùng qua van vào cốc thủy tinh 1.
- Lắc đều hỗn hợp còn lại trong phễu chiết và để lắng lần 3.
- Tách hết lớp dung dịch cuối cùng và thứ 2 qua van vào cốc thủy tinh 1. Tách riêng lớp dung mơi trên cùng có hịa tan hoạt chất sinh học của nấm ra riêng một bình tam giác có nắp giấy bạc - dịch chiết từ dung môi n – Hexane.
- Làm tương tự các bước trên tách chiết dịch nấm ở cốc thủy tinh 1 trên thêm 2 lần với dung môi n – Hexane (mỗi lần sau dùng khoảng 200ml n – Hexane).
Hình 3.2. Phễu tách chiết hoạt chất sinh học do nấm đối kháng Trichoderma
asperellum tiết ra bằng dung môi
- Dịch nuôi nấm được hịa cùng từng loại dung mơi và hoạt chất sinh học
sẽ hịa tan trong các loại dung mơi này. Thu tách lớp dung mơi đó và tiến hành cho bay hơi, cô đặc chúng ta được sản phẩm chiết thô – hợp chất sinh học.
- Dịch chiết từ dung môi n – Hexane tiến hành cho bay hơi, cô đặc bằng chân không được sản phẩm chiết thơ 1 (ký hiệu là H) (Hình 3.3.).
Hình 3.3. Tiến hành cho bay hơi, cơ đặc bằng chân không dịch chiết từ các dung môi
- Dung dịch đã loại bỏ lớp dung môi n - Hexane được hịa tan với dung mơi Ethyl acetate (EtOAc) và n - Butanol theo cách thức tương tự như đối với n - Hexane và tạo ra sản phẩm chiết thô 2 (ký hiệu là E) và 3 (ký hiệu B).
- Mỗi sản phẩm chiết thô được cân và giữ ở 5°C cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.5.3.3. Nghiên cứu đánh giá hiệu lực sinh học của các hợp chất sinh học thu được từ nấm đối kháng đối với nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long
Phương pháp nghiên cứu đánh giá hiệu lực sinh học của từng sản phẩm chiết thô – hợp chất sinh học với nấm Neoscytalidium dimidiatum
- Mỗi sản phẩm chiết sẽ được thử hoạt tính đối kháng ở các nồng độ 500,
1000 và 2000μg/ml. Mỗi sản phẩm chiết sẽ được hòa trong dung dịch Methanol (MeOH) 2 %.
- Nấm Neoscytalidium dimidiatum được nuôi cấy lỏng, dùng pipet hút dịch nuôi nấm bệnh cho vào môi trường PDA (đã hấp khử trùng, để nguội đến 40-50 0C) với tỷ lệ 0,5% lắc đều đổ ra các đĩa petri đã được vô trùng.
- Sau khi đĩa thạch chứa nấm bệnh đã khô bề mặt đánh dấu vị trí đặt 10
cơng thức thí nghiệm, gắp các đĩa giấy thấm đường kính 10mm đặt vào các vị trí, dùng micropipet nhỏ từng giọt dịch chiết nấm đối kháng tương ứng từng cơng thức thí nghiệm vào đĩa giấy thấm.
- Đặt đĩa thạch ở 28°C . Đường kính vịng đối kháng sẽ được đo ở 1, 2, 3 ngày. Gồm các công thức sau: tiến hành riêng rẽ với từng chủng Chaetomium và
Trichoderma
+ CT1: N. dimidiatum – Dịch nuôi nấm T. asperellum không qua lọc. + CT2: N. dimidiatum – H (Sản phẩm chiết thô từ n – Hexane)
+ CT3: N. dimidiatum – E (Sản phẩm chiết thô từ Ethyl acetate - EtOAc) + CT4: N. dimidiatum – B (Sản phẩm chiết thô từ n – Butanol)
3.6. XỬ LÝ SỐ LIỆU
Số liệu thu thập được xử lý thống kê trong Excel 2010 và chương trình
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});