2.3.2.1. Trichoderma
Nấm Trichoderma spp. hiện diện gần như trong tất cả các loại đất và trong một số môi trường sống khác. Chúng là loại nấm được nuôi cấy thông dụng nhất. Chúng hiện diện với mật độ cao và phát triển mạnh ở vùng rễ của cây, một số giống có khả năng phát triển ngay trên rễ. Những giống này có thể được bổ sung vào trong đất hay hạt giống bằng nhiều phương pháp. Ngay khi chúng tiếp xúc với rễ, chúng phát triển trên bề mặt rễ hay vỏ rễ phụ thuộc vào từng giống. Vì vậy, khi được dùng trong xử lý hạt giống, những giống thích hợp nhất sẽ phát triển trên bề mặt rễ ngay cả khi rễ phát triển dài hơn 1m phía dưới mặt đất và chúng có thể tồn tạo, còn hiệu lực cho đến 18 tháng sau khi sử dụng. Tuy nhiên, không có nhiều giống có khả năng này.
Trần Thị Thuần và cs. (2000) cho biết khi sử dụng chế phẩm nấm đối
kháng Trichoderma phòng trừ bệnh nấm lở cổ rễ hại lạc, đậu tương kết quả cho
thấy khi xử lý nấm đối kháng vào đất trước khi trồng đã hạn chế được bệnh, hiệu quả đạt từ 41,25 - 55,48%.
Ngoài sự hình thành khuẩn lạc trên rễ, nấm Trichoderma còn tấn công, ký
sinh và lấy chất dinh dưỡng từ các loài nấm khác. Bởi vì nơi Trichoderma phát triển tốt nhất là nơi có nhiều rễ khỏe mạnh, vì Trichoderma sở hữu nhiều cơ chế cho việc tấn công các loài nấm gây bệnh cũng như cơ chế cho việc nâng cao sự
sinh trưởng và phát triển của cây. Nhiều phương pháp mới trong kiểm soát sinh học và nâng cao sự sinh trưởng của cây hiện nay đã được chứng minh rõ ràng. Quá trình này được điều khiển bởi nhiều gen và sản phẩm từ gen khác nhau. Sau đây là một số cơ chế chủ yếu: Ký sinh nấm, kháng sinh, cạnh tranh chất dinh dưỡng và không gian; sự chịu đựng các điều kiện bất lợi bằng việc gia tăng sự phát triển của cây và rễ; làm hòa tan và cô lập chất dinh dưỡng vô cơ, cảm ứng sự kháng bệnh, bất hoạt enzyme gây bệnh (Dương Hoa Xô, 2005).
Trong tự nhiên nấm Trichoderma spp. luôn có mặt trong đất và là một vi
sinh vật có lợi cho cây trồng. Chúng có khả năng phân giải các chất hữu cơ cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng và còn là tác nhân sinh học đối kháng lại các loại
nấm gây bệnh cho cây trồng tồn tại trong đất như Rhizoctonia solani, Fusarium,
Sclecroium rolfsii, Verticillium, Botrytis...(Nguyễn Đăng Hiệp và cs., 2006). Cho đến nay, tác nhân sinh học trừ bệnh hại cây trồng được nghiên cứu nhiều hơn cả
là nhóm nấm đối kháng Trichoderma. Lê Minh Thi và cs. (1989) đã nghiên cứu
sản xuất nấm Trichoderma để sử dụng phòng trừ nấm Corticium sakii gây bệnh
khô vằn lúa và nấm S. rolfsii gây bệnh héo lạc .
Đỗ Tấn Dũng (2006) khi khảo sát hiệu lực của nấm T.viride với các isolate
nấm S. rolfsii trên môi trường nhân tạo thấy rằng khi nấm T. viride có mặt trước nấm gây bệnh thì bản thân nó có khả năng chiếm chỗ, cạnh tranh, ức chế và tiêu diệt nấm S.rolfsii và trong điều kiện chậu vại nấm đối kháng T. viride có thể
phòng trừ bệnh héo rũ gốc mốc nâu do nấm S. rolfsii hại cây đậu tương đạt hiệu
quả trừ bệnh. 94,4%. Trần Thị Thuần và cs (2000) cho biết khi sử dụng chế phẩm
nấm đối kháng Trichoderma phòng trừ bệnh nấm lở cổ rễ hại lạc, đậu tương kết
quả cho thấy khi xử lý nấm đối kháng vào đất trước khi trồng đã hạn chế được bệnh, hiệu quả đạt từ 41,25 - 55,48%.
Nấm Trichoderma spp. được ứng dụng để bảo vệ cây trồng chống các
nấm và vi khuẩn gây bệnh. Nấm Trichoderma spp. đối kháng với nấm gây bệnh
cây trồng thông qua nhiều cơ chế bao gồm ký sinh, chất kháng sinh và enzyme phân hủy vách tế bào của nấm bệnh (Nguyễn Văn Đĩnh và cs., 2007).
Hồng Châu (2009) cho rằng nấm Trichoderma giúp thúc đẩy tiến trình phân giải chất hữu cơ nhanh hơn được dùng để ủ phân chuồng, phân xanh sẽ rút ngắn thời gian hoai mục.
Trichoderma viride xử lý hạt giống, củ giống, tưới, trộn với phân hữu cơ bón vào đất đều có tác dụng phòng trừ một số bệnh nấm hại vùng rễ của cây lạc và cây khoai tây như bệnh lở thân, héo gốc mốc trắng và bệnh héo vàng…
2.3.2.1. Chaetomium
Nấm đối kháng Chaetomium lần đầu tiên được nghiên cứu ở Viện Di truyền Nông nghiệp. Các nghiên cứu thử nghiệm hiệu lực chế phẩm sinh học
trừ nấm Chaetomium được sản xuất từ các chủng nấm Chaetomium globosum
và Chaetomium cupreum của Thái Lan. Lê Thị Ánh Hồng, Trần Duy Quý và cs cho biết chế phẩm có hiệu lực cao trong phòng chống nhiều loại bệnh hại lan truyền qua đất (soilborn diseases) và có hiệu lực với một số bệnh lan truyền qua không khí (airborn diseases). Kết quả phân lập và định danh các
loài Chaetomium đã phân lập và định danh được 4 loài Chaetomium. Kết quả (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
thử nghệm 2 loài Chaetomium globosum và Chaetomium cupreum có khả
năng đối kháng cao nhiều bệnh nấm hại như: Curvularia lunnata,
Fussarium.o.lycopersici, Sclerotium rolfsii, Pyrcularia oryzae, P.palmivora, C.gloeosporioides, P.parasitica.
Ở Việt Nam, nấm đối kháng Chaetomium lần đầu tiên được nghiên cứu ở
Viện Di truyền nông nghiệp vào năm 1999. Các nghiên cứu, tìm kiếm, định danh
các loài Chaetomium đã được thực hiện. Sau khi đã phân lập và định danh được 4
loài Chaetomium, các nghiên cứu thử khả năng đối kháng của 2 loài Chaetomium
globosum và Chaetomium cupreum đã được thực hiện trong phòng thí nghiệm, chúng tỏ ra có khả năng đối kháng cao với nhiều loại nấm bệnh hại như:
Curvularia lunata, Fusarium olucopersici, Sclerotium rolfsii, Pyricularia oryzae, Colletotrichum gloeosporioides... Các nghiên cứu của Viện Di truyền cho thấy: hai loài nấm Chaetomium cupreum và Chaetomium globosum phát triển ở điều kiện pH từ 4,8-6,5, nhưng độ pH tối ưu cho chúng là trong khoảng từ 5-6. Hai loài nấm này có thể sinh trưởng phát triển trong phổ nhiệt độ rất rộng 3-52o
C.
Điều kiện tối ưu cho việc sinh bào tử sản lượng cao là từ 25-27oC. Năm 2002-
2003 Viện Di truyền nông nghiệp đã sản xuất thử thành công chế phẩm trừ nấm sinh học từ các chủng Chaetomium được tìm thấy ở Việt Nam, với tên là ChaeVDT và đã tiến hành thử hiệu lực chế phẩm trừ nấm sinh học này trên một số loài cây trồng như: cam Canh, thông, hoa hồng, hoa cúc và cà chua (Lê Thị Ánh Hồng, 2005).
Trong thời gian từ năm 2001 đến nay, Viện Di truyền Nông nghiệp tiếp tục nghiên cứu vi sinh vật có lợi và tập chung nghiên cứu nấm đối kháng để
phòng trừ các loại nấm bệnh hại cây trồng như: Chaetomium, Trichoderma… và
nhận thấy nấm đối kháng có rất nhiều ưu điểm có thể khai thác trong phòng và đặc trị các loại nấm gây hại vì chúng tác động theo nhiều cơ chế và lợi ích khác nhau như:
+ Sản sinh ra kháng sinh
Chaetomium được biết đến là một loại nấm có khả năng tổng hợp một số hợp chất sinh học. Cho tới nay, 4 hoạt chất sinh học đã được xác định từ nấm
Chaetomium (Kaewchai et al., 2009; Soytong et al., 2001). Các hoạt chất này bao gồm:
Chaetoglobusin C: có khả năng ức chế sinh trưởng của một số nấm gây
bệnh cây như Colletotrichum gloeosporioides, Col. dematium, Fusarium
oxysporum, Phytophthora palmivora, P. parasitica, P. cactorum, Pyricularia oryzae, Rhizoctonia solani and Sclerotium rolfsii (Soytong et al., 2001).
Chaetoviridins A và B: có khả năng ức chế sinh trưởng một số nấm như
Pyricularia oryzae, Pythium ultimum (Park et al., 2005).
Rotiorinols do nấm C. cupreum tạo ra có khả năng ức chế sinh trưởng của
nhiều tác nhân gây bệnh gồm cả nấm và vi khuẩn (Kanokmedhakul et al., 2006).
+ Ký sinh (mycoparasism)
Ký sinh trực tiếp là khả năng của vi sinh vật đối kháng sử dụng các
enzymes của chúng để tấn công tác nhân gây bệnh. Chaetomium là nhóm nấm có
hệ enzyme ngoại bào phong phú. Chúng có khả năng tạo các enzyme cellulases, chitinases và b-1,3-glucanases. Các enzyme này giúp Chaetomium có thể phân hủy vách tế bào nấm thật (fungi) được cấu tạo bởi chitin (là các chuỗi N-acetyl- D-glucosamine không phân nhánh) và β-1,3-glucan hay vách tế bào của nấm trứng (Phytophthora, Pythium), được cấu tạo bởi cellulose và glucan (Cao et al., 2009; Gao et al., 2005a; Gao et al., 2005b; Kaewchai et al., 2009; Sun et al., 2006; Ya-fen and Jin-jie, 2005).
+ Tăng sức đề kháng của cây (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Một cơ chế nữa cũng phải kể đến là chính Chaetoglobosin C do
trồng (IR, Iduced Resistance). Khả năng này thực hiện vai trò kích thích tính miễn dịch của cây trồng làm cho nó có khả năng kháng bệnh. Sự oxy hóa mạnh mẽ trong thực vật có thể phân loại nhờ khả năng sinh sản nhanh chóng của các loài có ôxy hoạt hóa tức thời sau khi có biểu hiện của một vài stresses. Các loài có ôxy hoạt hóa đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra các tín hiệu ban đầu phản ứng lại với các stress (Doke, 1997). Hiện tượng ôxy hóa mạnh mẽ này được coi là đèn tín hiệu trong các mô tế bào thực vật chống lại sự tấn công của các vi sinh vật gây bệnh, bảo vệ chính bản thân nó. Khả năng làm tăng tính kháng cho cây nhờ vào việc kích thích Phytoalexin trong cây trồng là chất kích thích hệ miễn dịch của cây hình thành các phản ứng bảo vệ của cây và kìm hãm sự phát triển của nấm bệnh (Doke et al., 1991, 1997).
Các thí nghiệm đã cho thấy Chaetomium cảm ứng hình thành các lớp oxy
hoạt hóa (ROS, reactive oxygen classes) – là các phân tử dẫn truyền tín hiệu để cảm ứng tạo thành tính kháng tập nhiễm trên cây cà rốt, khoai tây, khoai lang, thuốc lá (Kanokmedhakul et al., 2002; Soytong et al., 2001).
Hiện nay bệnh đốm nâu trên cây thanh long chưa có sản phẩm nào có khả năng hạn chế được bệnh cao. Do đó việc nhiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh đối kháng phòng trừ bệnh đốm nâu cây trồng nói chung và cây thanh long nói riêng là rất cần thiết. Sản phẩm không chỉ hạn chế được bệnh đốm nâu mà còn mang lại lợi ích kinh tế, xã hội và bảo vệ môi trường vùng sản xuất.
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
- Nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long.
- Nấm đối kháng Trichoderma asperellum, Trichoderma harzianum và
Chaetomium sp.
3.2. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Địa điểm nghiên cứu:
- Bộ môn Bệnh cây – Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
- Viện Di truyền nông nghiệp.
- Viện Hóa học công nghiệp Việt Nam.
Thời gian thực hiện đề tài: Từ tháng 3/2017 đến tháng 3/2018.
3.3. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 3.3.1. Thu thập mẫu, cây thí nghiệm 3.3.1. Thu thập mẫu, cây thí nghiệm
- Nguồn nấm gây bệnh được phân lập từ nấm bệnh đốm nâu thanh long
- Nguồn nấm đối kháng: nấm đối kháng Trichoderma asperellum và
Trichoderma harzianum được cung cấp bởi Bộ môn Bệnh cây – Học viện Nông
nghiệp Việt Nam.Nấm đối kháng Chaetomium sp. được cung cấp bởi Trung tâm
nghiên cứu Bệnh cây Nhiệt đới – Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
3.3.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất nghiên cứu
* Dụng cụ
- Nồi hấp, tủ lạnh, buồng cấy nấm, kính hiển vi, cân điện tử, giá nuôi cấy nấm, xoong, tủ sấy.
- Các dụng cụ nhỏ: cân kỹ thuật, bình đựng nước, bình tam giác, đũa thủy tinh, bếp điện, vải màn lọc, hộp lồng petri, que cấy nấm. Đèn cồn, khay đựng, giấy ẩm, dao, kéo, panh, chậu nhựa, kính lúp, túi lấy mẫu các loại, giấy bạc, màng bọc thực phẩm...
* Hóa chất
- Agar, đường glucose, sucrose, khoai tây, cà rốt, nước cất vô trùng,... - Dung môi tách chiết hoạt chất sinh học:
+ Dung môi: Ethyl acetate (EtOAc)
+ Dung môi: n – Butanol và một số dung môi khác. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU3.4.1. Trong phòng thí nghiệm 3.4.1. Trong phòng thí nghiệm
- Phân lập, nuôi cấy nấm bệnh Neoscytalidium dimidiatum trên môi
trường PDA, WA, PCA từ đó quan sát đặc điểm hình thái: tản nấm, sợi nấm,...và đặc điểm sinh học của nấm bệnh.
- Nghiên cứu đặc tính sinh học nấm đối kháng Trichoderma
asperellum, Trichoderma harzianum và Chaetomium sp. đối với nấm
Neoscytalidium dimidiatum.
Thử nghiệm hiệu lực ức chế của nấm Trichoderma và Chaetomium sp. đối
với nấm gây bệnh đốm nâu thanh long Neoscytalidium dimidiatum.
- Nghiên cứu quy trình tách chiết và lựa chọn dung môi để tách chiết các hoạt chất sinh học được tiết ra trong quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm
Chaetomium sp. và Trichoderma.
- Nghiên cứu đánh giá hiệu lực sinh học của các hợp chất sinh học thu
được từ nấm đối kháng Chaetomium sp. và Trichoderma đối với nấm
Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh trên cây thanh long.
3.5. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Phƣơng pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm * Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy
Đĩa petri, ống đong, ống nghiệm, bình tam giác, đũa thủy tinh được sấy khử trùng ở 140oC trong 2 giờ.
* Môi trƣờng WA (Water Agar medium)
Thành phần môi trường:
- Nước cất: 1000ml - Agar: 20g
Phương pháp điều chế: Agar được hòa tan trong nước đun sôi và hấp vô trùng trong điều kiện 121oC (1,5atm) trong thời gian 45 phút. Môi trường sau khi
hấp xong để nguội dần khoảng 60oC rồi đổ vào các đĩa petri 5ml/đĩa với lượng môi
trường này thao tác cát một bào tử sẽ dễ dàng hơn. Môi trường này dùng để phân lập nấm ban đầu, ít bị lẫn tạp do nghèo dinh dưỡng và để nuôi cấy đơn bào tử.
* Môi trƣờng PDA (Potato D-Glucose Agar)
Đây là môi trường giàu dinh dưỡng dùng để nuôi cấy làm thuần nấm để quan sát các đặc điểm hình thái, màu sắc, đo kích thước sợi nấm, sắc tố tản nấm sinh ra trên môi trường là các chỉ tiêu để phân loại nấm.
Thành phần môi trường: - Khoai tây: 200g - Agar: 20g - Đường Glucose: 20g - Nước cất: 1000ml
Phương pháp điều chế: Chọn những củ khoai tây không bị bệnh, còn nguyên vẹn, gọt sạch vỏ, cắt thành từng miếng nhỏ. Cho khoai tây trên vào nước cất với liều lượng đã định sẵn, đun sôi 15-20 phút, sau đó lọc sạch bằng vải màn, bỏ bã khoai tây, chỉ lấy dịch trong, bổ sung nước cất cho đủ liều lượng. Tiếp đó cho từ từ agar và đường glucose đã cân đủ lượng vào dịch khoai tây khuấy đều cho tan hết rồi đun sôi lại dịch khoai tây. Sau đó cho vào bình tam giác, phủ giấy bạc rồi khử trùng trong nồi hấp ở điều kiện 121oC (1.5atm) trong thời gian 45
phút. Sau khi hấp xong lấy ra để nguội môi trường đến nhiệt độ 60oC (để tránh
tạp khuẩn, cho thêm thuốc kháng sinh Penicillin hoặc Steptomycin với liều lượng 10mg/100ml). Sau đó lắc đều rồi đổ ra các đĩa Petri (đã được khử trùng và sấy khô từ trước). Lượng môi trường từ 10-15ml/đĩa Petri. Sau khi môi trường đông cứng có thể tiến hành phân lập và nuôi cấy nấm.
* Môi trƣờng PCA (Potato Carot Agar)
Thành phần: -Nước cất: 1000ml -Khoai tây: 100g - Cà rốt: 100g - Đường Glucose: 20g - Agar: 20g (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phương pháp điều chế: Chọn những củ khoai tây, cà rốt không bị bệnh, còn nguyên vẹn, gọt sạch vỏ, cắt thành từng miếng nhỏ. Cho khoai tây và cà rốt trên vào nước cất với liều lượng đã định sẵn, đun sôi 15-20 phút, sau đó lọc sạch bằng vải màn, bỏ bã khoai tây, chỉ lấy dịch trong, bổ sung nước cất cho đủ liều
lượng. Tiếp đó cho từ từ agar và đường glucose đã cân đủ lượng vào dịch khoai tây, cà rốt khuấy đều cho tan hết rồi đun sôi lại dịch khoai tây, cà rốt. Sau đó cho vào bình tam giác, phủ giấy bạc rồi khử trùng trong nồi hấp ở điều kiện 121oC (1.5atm) trong thời gian 45 phút. Sau khi hấp xong lấy ra để nguội môi trường đến nhiệt độ 60o
C.
* Môi trƣờng PDB (Potato Dextrose Broth) Thành phần:
- Nước cất: 1000 ml - Khoai tây: 200g - Đường glucose: 20g
Phương pháp điều chế: Chọn những củ khoai tây không bị bệnh, còn nguyên vẹn, gọt sạch vỏ, cắt thành từng miếng nhỏ. Cho khoai tây trên vào nước cất với liều lượng đã định sẵn, đun sôi 15-20 phút, sau đó lọc sạch bằng vải màn, bỏ bã khoai tây, chỉ lấy dịch trong, bổ sung nước cất cho đủ liều lượng. Tiếp đó