Việt Nam
Trong những năm gần đây, các nhà khoa học Việt Nam cũng đã bắt đầu quan tâm và tiến hành nghiên cứu về nấm rễ Mycorrhizae và khả năng ứng dụng của chúng trong sản xuất nông, lâm nghiệp và xử lý ô nhiễm môi trường.
Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam đã tiến hành phân lập nấm nội cộng sinh trong đất vườn ươm cộng sinh với một số loài cây gỗ bản địa như sao đen, dái ngựa, dẻ cau và lim xanh. Kết quả phân lập bước đầu cho thấy mỗi loại cây khác nhau mật độ bào tử nấm nội cộng sinh và thành phần loài nấm cộng sinh tồn tại trong đất khác nhau. Cây chủ đóng vai trò nhất định trong sự tồn tại và phát triển của những loài nấm nội cộng sinh. Mật độ nấm tập trung nhiều ở tầng đất mặt có độ sâu 0 – 10 cm, khi xuống sâu hơn mật độ giảm rõ rệt. Kết quả khẳng định tiềm năng nấm nội cộng sinh trong đất là rất lớn (Nguyễn Thị Hoàng Yến và cs., 2005).
Nghiên cứu của Nguyễn Thị Minh (2005, 2007, 2014) đã tiến hành phân lập AM trên một số thực vật trên đất phù sa sông Hồng và đất bạc màu gồm các loại cây họ đậu, họ hòa thảo, cây ăn quả, cây họ cúc và cũng thu được các giống nấm rễ có sức sống và khả năng cộng sinh cao. Các nghiên cứu này khẳng định, sự cộng sinh của nấm rễ trên cây chủ giúp cho cây có sức sống cao hơn, có khả năng chống chịu cao với các điều kiện bất lợi của môi trường sống, giúp tái tạo thành công thảm thực vật.
Phan Quốc Hưng và cs. (2010) đã sử dụng nấm rễ là một trong các loại sinh vật kết hợp với thực vật để xử lý đất nông nghiệp bị ô nhiễm kim loại nặng do khả năng chống chịu và chuyển hoá khoáng chất cao của nấm rễ trong đất giúp tăng cường khả năng hấp thụ cho cây lấy đi.
Trần Thị Dạ Thảo (2007) đã nghiên cứu về nấm rễ trên cây ngô. Kết quả nghiên cứu cho thấy nấm rễ có khả năng rất lớn trong việc tiết kiệm nước tưới, tăng hấp thu dinh dưỡng và tăng năng suất cây trồng. Khi không có nấm trong môi trường đất thì cây sinh trưởng rất yếu, chiều cao cây thấp, diện tích lá nhỏ, lá chậm lão hóa, nhưng có nấm thì cây sinh trưởng tốt hơn; Giữ lân ở mức 100 mg P2O5/1kg đất kết hợp với chủng nấm Glomus sp. Điều này có ý nghĩa trong việc giảm lượng phân bón cho cây trồng trong sản xuất.
Công ty Thời Đại Xanh Thành phố Hồ Chí Minh đã sản xuất chế phẩm sinh học với thành phần chính: Nấm Mycorrhizae 250 – 300 bào tử/ 10g với công dụng giúp cho Mycorrhizae phát triển cộng sinh trên rễ thúc đẩy rễ cây tăng trưởng nhanh và mạnh, hấp thu đầy đủ dinh dưỡng khoáng và nước làm cho cây kháng lại các bệnh ở rễ, chống chịu các điều kiện bất lợi cho đất như chua, mặn và khô hạn. Có thể áp dụng cho tất cả các loại cây trồng. Bón trực tiếp vào bộ rễ ở các giai đoạn hay làm nguyên liệu phối hợp với các phân hữu cơ và vi sinh khác.
Nguyễn Minh Châu và Lê Quốc Huy (Trung tâm Công nghệ sinh học Lâm nghiệp – Viện khoa học Lâm nghiệp) đã tiến hành nghiên cứu sản xuất thử nghiệm chế phẩm nấm rễ ECM dưới dạng viên nang, thử nghiệm một số dung dịch bảo quản chế phẩm và đánh giá hiệu quả cộng sinh của chế phẩm dạng viên nang với cây sao đen trong vườn ươm và ngoài đồng ruộng. Kết quả nghiên cứu cho thấy, chế phẩm nấm rễ ECM dạng viên nang được tạo ra với tỷ lệ đồng nhất về vật liệu và kích cỡ viên (0,2 – 0,3), năng suất 1g sinh khối sợi nấm tinh khiết sản xuất được 100g chế phẩm ECM viên nang bằng kỹ thuật “tạo viên nang” trong dung dịch CaCl2 0,1M. Chế phẩm nấm rễ ECM sản xuất dưới dạng viên nang này có nhiều ưu điểm hơn các dạng khác. Sợi nấm được bọc trong thể keo alginate nên có khả năng tránh được sự tấn công của các vi sinh vật khác (Tạp chí Nông nghiệp và PTNT, 2007).
Tuy nhiên, việc nghiên cứu ứng dụng của nấm rễ cộng sinh chưa thực sự được triển khai rộng rãi ở Việt Nam, đặc biệt là nghiên cứu nhằm mục đích tái tạo thảm thực vật làm đẹp cho cảnh quan đô thị nhờ các vật liệu sinh học được sản xuất từ nấm rễ.
2.6. VI KHUẨN NỐT SẦN RHIZOBIUM 2.6.1. Một vài đặc điểm của Rhizobium
Vi khuẩn Rhizobium có trong đất, có thể xâm nhiễm vào rễ cây họ đậu tạo thành nốt sần nên được gọi là vi khuẩn nốt sần. Vi khuẩn Rhizobium thuộc loại vi
khuẩn hiếu khí, có dạng hình que, kích thước 0,5 – 0,9 x 1,2 – 3 µm. Khi còn non có khả năng di động nhờ tiên mao, không sinh bào tử và sinh sản bằng cách phân bào.
Dựa vào tốc độ phát triển trên môi trường đặc nhân tạo, người ra chia vi khuẩn nốt sần thành hai nhóm chính:
+ Nhóm axit hóa môi trường: Nhóm vi khuẩn này trong quá trình sinh trưởng và phát triển sản sinh ra các chất làm giảm pH của môi trường như:
Shinorhizobium fredii….
+ Nhóm kiềm hóa môi trường: Nhóm vi khuẩn này trong quá trình sinh trưởng và phát triển sản sinh ra các chất làm tăng pH của môi trường như:
Bradyrhizobium japonicum, Bradyrhizobium vigna…
Vi khuẩn Rhizobium có thể đồng hóa photpho, kali, canxi và các nguyên tố khác từ các hợp chất vô cơ và hữu cơ. Trong vùng rễ cây họ đậu, gặp điều kiện thuận lợi vi khuẩn Rhizobium sinh sản rất nhanh. Chúng tiết ra một số hoạt chất làm mềm lớp biểu bì lông hút, sau đó xâm nhập vào kẽ nốt trên lông hút của biểu bì và tiếp tục phát triển tạo thành “sợi xâm nhiễm”. Lông hút quăn lại, sợi xâm nhiễm ăn sâu vào vỏ rễ, kích thích vỏ rễ phát triển tạo ra lớp mô phân sinh để từ đó hình thành vỏ nốt sần. Bên trong nốt sần hình thành hệ thống mạch dẫn vận chuyển chất dinh dưỡng đến nốt sần và đưa đạm từ quá trình cộng sinh cố định nitơ khí quyển đến các bộ phận của cây (Ngô Thế Dân và cs.).
2.6.2. Tình hình sản xuất và sử dụng chế phẩm vi khuẩn nốt sần trên thế giới và ở Việt Nam và ở Việt Nam
Ở Mỹ, năm 1895 lần đầu tiên người ta đã sản xuất được nitragin – phân vi sinh từ vi khuẩn nốt sần để đưa vào ứng dụng trong nông nghiệp. Số lượng phân vi khuẩn nốt sần sản xuất ở Mỹ hằng năm có thể xử lý cho 650 nghìn tấn hạt giống cây họ đậu (Erdman, 1962). Năm 1968, hơn 70% diện tích trồng đậu đã được xử lý bằng chế phẩm vi sinh vật cố định đạm.
Thái Lan là nước sử dụng phân bón vi khuẩn nốt sần nhiều nhất Đông Nam Á. Theo đó, số lượng chế phẩm vi khuẩn nốt sần được sử dụng tại Thái Lan đã tăng từ 3,36 tấn/năm 1995 lên đến 203,28 tấn/ năm 1997.
Ở Việt Nam, phân bón vi sinh cố định đạm đã được nghiên cứu từ năm 1960 nhưng phải đến năm 1980 mới đem vào thử nghiệm cho cây đậu tương và chế phẩm Vinaga, Rhidafo cho cây lạc của trường đại học Cần Thơ. Viện khoa học kỹ thuật nông nghiệp Việt Nam phối hợp với đại học Nông Nghiệp I Hà Nội,
đại học Tổng hợp Hà Nội, sản xuất chế phẩm nitragin bón cho lạc, đậu tương đem lại kết quả khả quan. Đến năm 1987, quy trình sản xuất nitragin trên nền chất mang là than bùn hoàn thiện trong chương trình 52B-01-03.
Tuy nhiên, thực tế việc sản xuất các chế phẩm phân bón vi khuẩn nốt sần vẫn còn nhiều hạn chế như: chưa có nhà máy sản xuất chế phẩm với quy mô lớn để ứng dụng trong nông nghiệp đại trà… Chi Cỏ ba lá (danh pháp khoa học: trifolium) là một chi của 300 loài thực vật trong họ đậu. Chúng chủ yếu sinh sống ở các khu vực ôn đới của Bắc bán cầu, nhưng giống như nhiều chi khác ở khu vực ôn đới, chúng cũng sống ở các khu vực miền núi thuộc miền nhiệt đới. Các loại cây này là cây thân thảo sống một năm hoặc lâu năm có ba lá chét (rất hiếm cây có 5 hay 7 lá chét) với các lá kèm hợp sinh tại cuống lá và các cụm hoa có màu đỏ, tím, trắng (rất hiếm hoa màu vàng), các hạt nhỏ được che phủ trong đài hoa.
Cỏ ba lá (với danh pháp khoa học: Trifolium) là thức ăn có giá trị, do hàm lượng protein cao, phổ biến và phong phú. Ở dạng tươi, chúng khó tiêu hóa, nhưng có thể ăn sau khi luộc trong 5-10 phút. Hoa khô và hạt trong quả có thể chế biến thành bột có giá trị dinh dưỡng và trộn lẫn với các thức ăn khác. Hoa khô cũng có thể sử dụng như chè .Cây đậu mèo (Mucuna prurient thuộc họ đậu Febaceae) có nguồn gốc nhiệt đới châu Phi và châu Á. Ở Việt Nam, đậu mèo là cây bản địa phân bố ở các tỉnh miền núi, đặc biệt từ Quảng Bình trở ra. Cây có hàm lượng dinh dưỡng cao, đặc biệt là protein, lipit, khoáng và vitamin, có giá trị tương đương đậu tương. Đa số các giống đậu mèo đạt 40-50 quả/cây, 5-7 hạt/quả, 100-130 g/100 hạt, 400-500 g/cây và có tiềm năng năng suất 2,0-3,0 tấn/ha trong điều kiện khô hạn. Đặc biệt, kết quả nghiên cứu xác định được 8 giống có tiềm năng năng suất 3,36-5,0 tấn/ha. Đây là nguồn cứ liệu quan trọng trong mục tiêu phát triển nguồn nguyên liệu thức ăn chăn nuôi ở Việt Nam. (Lê Khả Tường (2014). Tạp chí NN & PTNT. Cỏ Đậu phụng, cỏ Lạc cảnh, cỏ Hoàng Lạc, Lạc dại.)
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
- Vật liệu sinh học nhằm tái tạo thảm cỏ làm tiểu cảnh cho khuôn viên.
3.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
- Giống vi sinh vật: Nấm rễ nội cộng sinh Arbuscular mycorrhizae và vi khuẩn nốt sần Rhizobium.
- Thực vật: giống cây họ hòa thảo.
- Một số nguyên liệu có thể dùng để làm nguyên liệu cho vật liệu sinh học: đất, than bùn, rơm rạ, phân rác.
3.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Thời gian: từ tháng 01/2015 – tháng 11/2015 Địa điểm: Học viện Nông Nghiệp Việt Nam. Cây cỏ: Cây lạc cảnh (Arachis pintoi)
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Tuyển chọn giống Arbuscular mycorrhizae và lựa chọn cây chủ để nhân giống dùng cho sản xuất.
- Tuyển chọn giống Rhizobium và xác định điều kiện nhân sinh khối tối ưu. - Xác định, lựa chọn và xử lý chất nền để sản xuất vật liệu sinh học.
- Lựa chọn loại dinh dưỡng và xác định tỷ lệ bổ sung vào vật liệu sinh học. - Lựa chọn hạt giống hoặc cây con để sản xuất vật liệu sinh học.
- Phối trộn vật liệu sinh học và kiểm tra chất lượng của vật liệu sinh học. Các chỉ tiêu chất lượng chính (độ ẩm, pH, mật độ AM, hàm lượng dinh dưỡng chính).
- Xây dựng quy trình sản xuất vật liệu sinh học gồm các bước, trình tự chuẩn bị và tỷ lệ phối trộn của các nguyên liệu tối ưu phù hợp với các bước trong quy trình đảm bảo cho các giống vi sinh vật và hạt giống (hoặc cây con) sinh trưởng phát triển tốt trên đất nghèo dinh dưỡng.
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Phương pháp thu thập tài liệu thứ cấp
Nghiên cứu tài liệu liên quan đến nguyên liệu và công nghệ sản xuất vật liệu sinh học, giá thể, chất nền sử dụng... từ các kênh:
- Báo, tạp chí khoa học;
- Các website, thông tin từ internet;
- Các ấn phầm nghiên cứu khoa học có liên quan; - Sách và tư liệu liên quan đến vấn đề nghiên cứu.
3.5.2. Phương pháp thu nhận bào tử từ vùng rễ của cây trồng theo phương pháp sàng ướt cải tiến pháp sàng ướt cải tiến
+ Mẫu đất được lấy ở vùng rễ ở độ sâu khoảng 15-20cm. Cho mẫu đất hòa vào 1 lít nước. Khuấy đều, loại bỏ tàn dư thực vật, bóp nhỏ những cục đất lớn. Để lắng 20 giây rồi đổ dung dịch qua bộ sàng với kích cỡ lỗ lần lượt từ trên xuống là 1.000 µm, 500 µm, 200 µm, 100 µm, 50µm. Quá trình này được lặp lại 3 lần. Những thành phần còn lại trên sàng được chuyển qua đĩa petri. Dùng kính hiển vi soi nổi để quan sát và nhặt bào tử AM ra khỏi đĩa petri, bảo quản bào tử trong nước vô trùng ở 40C.
+ Bào tử sau khi phân lập được phân loại theo phương pháp hình thái học theo hệ thống của Franke and Morton (1994);
+ Xác định hình dạng và kích thước bào tử: Bảng so sánh Morton (1988); + Màu sắc của bào tử được xác định bằng bảng màu chuẩn 4 nhân tố CMYB (Cyan/Mageta/Yellow/Black) (theo INVAM);
+ Số lượng bào tử AM: Xác định bằng phương pháp đo đếm trực tiếp (Brundett Mark và cộng sự).
3.5.3. Phương pháp phân lập vi khuẩn nốt sần Rhizobium
Mẫu nghiên cứu được lấy tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam từ các cây họ đậu (lạc, đậu tương, điền thanh) và các cây họ hòa thảo (cỏ gừng, cỏ tranh, cỏ mần trầu). Đất vùng rễ được lấy trong phạm vi 15-20 cm theo Phillip J.M. và Hayman D.S (1970). Với cây họ đậu, lấy nguyên bộ rễ để thu nhận nốt sần.
Phân lập các chủng giống vi khuẩn Rhizobium từ nốt sần cây họ đậu trên môi trường chuyên tính (YMA).
3.5.4. Phương pháp đánh giá đặc tính sinh học trực tiếp các giống Arbuscular mycorrhizae Arbuscular mycorrhizae
Đánh giá hoạt tính sinh học của các chủng giống AM theo phương pháp đánh giá đặc tính sinh học trực tiếp (tỷ lệ nảy mầm, sự phát triển của hệ sợi và quá trình sinh trưởng của bào tử nấm rễ trong dung dịch chiết và khả năng cộng sinh trên cây chủ). Dung dịch dinh dưỡng được chiết theo tỷ lệ 1:10, phân vào các ô của hộp nuôi cấy bằng plastic (2ml/ô). Bào tử Arbuscular mycorrhizae được khử trùng bề mặt bằng Chloramin T và Streptomycin rồi rửa sạch bằng nước vô trùng trước khi nuôi cấy trong dung dịch chiết (1 bào tử/ô, theo dõi 10 bào tử/giống) trong điều kiện tối ở 250C. Sau 30 ngày nuôi cấy, xác định số lượng bào tử theo các giai đoạn sinh trưởng khác nhau, sự phát triển của hệ sợi và sự nảy mầm của bào tử nấm rễ (Nguyễn Thị Minh và cs., 2005, 2014).
Đặc tính đánh giá:
- Theo dõi quá trình sinh trưởng của bào tử theo 4 cấp độ: + Giai đoạn ban đầu (Kiểu A): Chưa hình thành sợi. + Giai đoạn 2 (Kiểu B): Hình thành 1 sợi ngắn.
+ Giai đoạn phát triển (Kiểu C): Sợi nấm bắt đầu phân nhánh.
+ Giai đoạn trưởng thành (Kiểu D): Sợi nấm phân nhiều nhánh, hình thành các cấu trúc đặc trưng.
- Theo dõi tỷ lệ nảy mầm của bào tử và sự phát triển của hệ sợi sau 30 ngày nuôi cấy theo 3 mức phân hạng:
+ Phát triển nhẹ (mức I): Bào tử phát triển một vài sợi.
+Phát triển vừa phải (mức II): số lượng sợi nấm phát triển trung bình. +Phát triển mạnh (mức III): sợi nấm sinh trưởng mạnh tới mức tối đa với nhiều cấu trúc đa dạng.
3.5.5. Phương pháp đánh giá đặc tính sinh học trực tiếp các giống Rhizobium Rhizobium
Đánh giá hoạt tính sinh học của các chủng giống Rhizobium theo phương pháp nuôi cấy trực tiếp trên môi trường YMA ở các điều kiện khác nhau. Giống Rhizobium được phân loại dựa trên phản ứng đổi màu trên môi trường YMA có chứa Bromothymol blue (20mg/l) do khả năng axit hóa hay kiềm hóa môi trường của chủng giống Rhizobium khi sinh trưởng và phát triển (Saeki et al., 2005).
Khả năng cộng sinh của Rhizobium được đánh giá bằng thí nghiệm trên cát vô trùng và bổ sung dinh dưỡng không nitơ trên cây đậu xanh với 3 cây/chậu và dịch vi khuẩn được nhiễm vào hạt với 10ml dịch vi khuẩn/chậu. Điều kiện nhân sinh khối tối ưu của vi khuẩn Rhizobium được xác định bằng cách nuôi cấy trực tiếp trên môi trường chuyên tính ở các điều kiện khác nhau, xác định mật độ vi khuẩn hình thành.
3.5.6. Đánh giá khả năng cộng sinh trên cây chủ và lựa chọn cây chủ để nhân giống nấm rễ