và ở Việt Nam
Ở Mỹ, năm 1895 lần đầu tiên người ta đã sản xuất được nitragin – phân vi sinh từ vi khuẩn nốt sần để đưa vào ứng dụng trong nông nghiệp. Số lượng phân vi khuẩn nốt sần sản xuất ở Mỹ hằng năm có thể xử lý cho 650 nghìn tấn hạt giống cây họ đậu (Erdman, 1962). Năm 1968, hơn 70% diện tích trồng đậu đã được xử lý bằng chế phẩm vi sinh vật cố định đạm.
Thái Lan là nước sử dụng phân bón vi khuẩn nốt sần nhiều nhất Đông Nam Á. Theo đó, số lượng chế phẩm vi khuẩn nốt sần được sử dụng tại Thái Lan đã tăng từ 3,36 tấn/năm 1995 lên đến 203,28 tấn/ năm 1997.
Ở Việt Nam, phân bón vi sinh cố định đạm đã được nghiên cứu từ năm 1960 nhưng phải đến năm 1980 mới đem vào thử nghiệm cho cây đậu tương và chế phẩm Vinaga, Rhidafo cho cây lạc của trường đại học Cần Thơ. Viện khoa học kỹ thuật nông nghiệp Việt Nam phối hợp với đại học Nông Nghiệp I Hà Nội,
đại học Tổng hợp Hà Nội, sản xuất chế phẩm nitragin bón cho lạc, đậu tương đem lại kết quả khả quan. Đến năm 1987, quy trình sản xuất nitragin trên nền chất mang là than bùn hoàn thiện trong chương trình 52B-01-03.
Tuy nhiên, thực tế việc sản xuất các chế phẩm phân bón vi khuẩn nốt sần vẫn còn nhiều hạn chế như: chưa có nhà máy sản xuất chế phẩm với quy mô lớn để ứng dụng trong nông nghiệp đại trà… Chi Cỏ ba lá (danh pháp khoa học: trifolium) là một chi của 300 loài thực vật trong họ đậu. Chúng chủ yếu sinh sống ở các khu vực ôn đới của Bắc bán cầu, nhưng giống như nhiều chi khác ở khu vực ôn đới, chúng cũng sống ở các khu vực miền núi thuộc miền nhiệt đới. Các loại cây này là cây thân thảo sống một năm hoặc lâu năm có ba lá chét (rất hiếm cây có 5 hay 7 lá chét) với các lá kèm hợp sinh tại cuống lá và các cụm hoa có màu đỏ, tím, trắng (rất hiếm hoa màu vàng), các hạt nhỏ được che phủ trong đài hoa.
Cỏ ba lá (với danh pháp khoa học: Trifolium) là thức ăn có giá trị, do hàm lượng protein cao, phổ biến và phong phú. Ở dạng tươi, chúng khó tiêu hóa, nhưng có thể ăn sau khi luộc trong 5-10 phút. Hoa khô và hạt trong quả có thể chế biến thành bột có giá trị dinh dưỡng và trộn lẫn với các thức ăn khác. Hoa khô cũng có thể sử dụng như chè .Cây đậu mèo (Mucuna prurient thuộc họ đậu Febaceae) có nguồn gốc nhiệt đới châu Phi và châu Á. Ở Việt Nam, đậu mèo là cây bản địa phân bố ở các tỉnh miền núi, đặc biệt từ Quảng Bình trở ra. Cây có hàm lượng dinh dưỡng cao, đặc biệt là protein, lipit, khoáng và vitamin, có giá trị tương đương đậu tương. Đa số các giống đậu mèo đạt 40-50 quả/cây, 5-7 hạt/quả, 100-130 g/100 hạt, 400-500 g/cây và có tiềm năng năng suất 2,0-3,0 tấn/ha trong điều kiện khô hạn. Đặc biệt, kết quả nghiên cứu xác định được 8 giống có tiềm năng năng suất 3,36-5,0 tấn/ha. Đây là nguồn cứ liệu quan trọng trong mục tiêu phát triển nguồn nguyên liệu thức ăn chăn nuôi ở Việt Nam. (Lê Khả Tường (2014). Tạp chí NN & PTNT. Cỏ Đậu phụng, cỏ Lạc cảnh, cỏ Hoàng Lạc, Lạc dại.)
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
- Vật liệu sinh học nhằm tái tạo thảm cỏ làm tiểu cảnh cho khuôn viên.
3.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
- Giống vi sinh vật: Nấm rễ nội cộng sinh Arbuscular mycorrhizae và vi khuẩn nốt sần Rhizobium.
- Thực vật: giống cây họ hòa thảo.
- Một số nguyên liệu có thể dùng để làm nguyên liệu cho vật liệu sinh học: đất, than bùn, rơm rạ, phân rác.
3.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Thời gian: từ tháng 01/2015 – tháng 11/2015 Địa điểm: Học viện Nông Nghiệp Việt Nam. Cây cỏ: Cây lạc cảnh (Arachis pintoi)
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Tuyển chọn giống Arbuscular mycorrhizae và lựa chọn cây chủ để nhân giống dùng cho sản xuất.
- Tuyển chọn giống Rhizobium và xác định điều kiện nhân sinh khối tối ưu. - Xác định, lựa chọn và xử lý chất nền để sản xuất vật liệu sinh học.
- Lựa chọn loại dinh dưỡng và xác định tỷ lệ bổ sung vào vật liệu sinh học. - Lựa chọn hạt giống hoặc cây con để sản xuất vật liệu sinh học.
- Phối trộn vật liệu sinh học và kiểm tra chất lượng của vật liệu sinh học. Các chỉ tiêu chất lượng chính (độ ẩm, pH, mật độ AM, hàm lượng dinh dưỡng chính).
- Xây dựng quy trình sản xuất vật liệu sinh học gồm các bước, trình tự chuẩn bị và tỷ lệ phối trộn của các nguyên liệu tối ưu phù hợp với các bước trong quy trình đảm bảo cho các giống vi sinh vật và hạt giống (hoặc cây con) sinh trưởng phát triển tốt trên đất nghèo dinh dưỡng.
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Phương pháp thu thập tài liệu thứ cấp
Nghiên cứu tài liệu liên quan đến nguyên liệu và công nghệ sản xuất vật liệu sinh học, giá thể, chất nền sử dụng... từ các kênh:
- Báo, tạp chí khoa học;
- Các website, thông tin từ internet;
- Các ấn phầm nghiên cứu khoa học có liên quan; - Sách và tư liệu liên quan đến vấn đề nghiên cứu.
3.5.2. Phương pháp thu nhận bào tử từ vùng rễ của cây trồng theo phương pháp sàng ướt cải tiến pháp sàng ướt cải tiến
+ Mẫu đất được lấy ở vùng rễ ở độ sâu khoảng 15-20cm. Cho mẫu đất hòa vào 1 lít nước. Khuấy đều, loại bỏ tàn dư thực vật, bóp nhỏ những cục đất lớn. Để lắng 20 giây rồi đổ dung dịch qua bộ sàng với kích cỡ lỗ lần lượt từ trên xuống là 1.000 µm, 500 µm, 200 µm, 100 µm, 50µm. Quá trình này được lặp lại 3 lần. Những thành phần còn lại trên sàng được chuyển qua đĩa petri. Dùng kính hiển vi soi nổi để quan sát và nhặt bào tử AM ra khỏi đĩa petri, bảo quản bào tử trong nước vô trùng ở 40C.
+ Bào tử sau khi phân lập được phân loại theo phương pháp hình thái học theo hệ thống của Franke and Morton (1994); (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Xác định hình dạng và kích thước bào tử: Bảng so sánh Morton (1988); + Màu sắc của bào tử được xác định bằng bảng màu chuẩn 4 nhân tố CMYB (Cyan/Mageta/Yellow/Black) (theo INVAM);
+ Số lượng bào tử AM: Xác định bằng phương pháp đo đếm trực tiếp (Brundett Mark và cộng sự).
3.5.3. Phương pháp phân lập vi khuẩn nốt sần Rhizobium
Mẫu nghiên cứu được lấy tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam từ các cây họ đậu (lạc, đậu tương, điền thanh) và các cây họ hòa thảo (cỏ gừng, cỏ tranh, cỏ mần trầu). Đất vùng rễ được lấy trong phạm vi 15-20 cm theo Phillip J.M. và Hayman D.S (1970). Với cây họ đậu, lấy nguyên bộ rễ để thu nhận nốt sần.
Phân lập các chủng giống vi khuẩn Rhizobium từ nốt sần cây họ đậu trên môi trường chuyên tính (YMA).
3.5.4. Phương pháp đánh giá đặc tính sinh học trực tiếp các giống Arbuscular mycorrhizae Arbuscular mycorrhizae
Đánh giá hoạt tính sinh học của các chủng giống AM theo phương pháp đánh giá đặc tính sinh học trực tiếp (tỷ lệ nảy mầm, sự phát triển của hệ sợi và quá trình sinh trưởng của bào tử nấm rễ trong dung dịch chiết và khả năng cộng sinh trên cây chủ). Dung dịch dinh dưỡng được chiết theo tỷ lệ 1:10, phân vào các ô của hộp nuôi cấy bằng plastic (2ml/ô). Bào tử Arbuscular mycorrhizae được khử trùng bề mặt bằng Chloramin T và Streptomycin rồi rửa sạch bằng nước vô trùng trước khi nuôi cấy trong dung dịch chiết (1 bào tử/ô, theo dõi 10 bào tử/giống) trong điều kiện tối ở 250C. Sau 30 ngày nuôi cấy, xác định số lượng bào tử theo các giai đoạn sinh trưởng khác nhau, sự phát triển của hệ sợi và sự nảy mầm của bào tử nấm rễ (Nguyễn Thị Minh và cs., 2005, 2014).
Đặc tính đánh giá:
- Theo dõi quá trình sinh trưởng của bào tử theo 4 cấp độ: + Giai đoạn ban đầu (Kiểu A): Chưa hình thành sợi. + Giai đoạn 2 (Kiểu B): Hình thành 1 sợi ngắn.
+ Giai đoạn phát triển (Kiểu C): Sợi nấm bắt đầu phân nhánh.
+ Giai đoạn trưởng thành (Kiểu D): Sợi nấm phân nhiều nhánh, hình thành các cấu trúc đặc trưng.
- Theo dõi tỷ lệ nảy mầm của bào tử và sự phát triển của hệ sợi sau 30 ngày nuôi cấy theo 3 mức phân hạng:
+ Phát triển nhẹ (mức I): Bào tử phát triển một vài sợi.
+Phát triển vừa phải (mức II): số lượng sợi nấm phát triển trung bình. +Phát triển mạnh (mức III): sợi nấm sinh trưởng mạnh tới mức tối đa với nhiều cấu trúc đa dạng.
3.5.5. Phương pháp đánh giá đặc tính sinh học trực tiếp các giống Rhizobium Rhizobium
Đánh giá hoạt tính sinh học của các chủng giống Rhizobium theo phương pháp nuôi cấy trực tiếp trên môi trường YMA ở các điều kiện khác nhau. Giống Rhizobium được phân loại dựa trên phản ứng đổi màu trên môi trường YMA có chứa Bromothymol blue (20mg/l) do khả năng axit hóa hay kiềm hóa môi trường của chủng giống Rhizobium khi sinh trưởng và phát triển (Saeki et al., 2005).
Khả năng cộng sinh của Rhizobium được đánh giá bằng thí nghiệm trên cát vô trùng và bổ sung dinh dưỡng không nitơ trên cây đậu xanh với 3 cây/chậu và dịch vi khuẩn được nhiễm vào hạt với 10ml dịch vi khuẩn/chậu. Điều kiện nhân sinh khối tối ưu của vi khuẩn Rhizobium được xác định bằng cách nuôi cấy trực tiếp trên môi trường chuyên tính ở các điều kiện khác nhau, xác định mật độ vi khuẩn hình thành.
3.5.6. Đánh giá khả năng cộng sinh trên cây chủ và lựa chọn cây chủ để nhân giống nấm rễ nhân giống nấm rễ
Khả năng cộng sinh của các chủng nấm rễ được đánh giá thông qua việc xử lý AM trên cây chủ bằng thí nghiệm chậu vại theo phương pháp của Viencent (1976). Thí nghiệm được bố trí với ba lần nhắc lại trong chậu đất vô trùng (100g) đối với cây họ hòa thảo đã lựa chọn.
Hạt giống được khử trùng trong dung dịch NaClO 10%, rửa sạch bằng nước cất rồi cho nảy mầm trên giấy lọc ẩm trong đĩa petri vô trùng ở 250C. Sau khi hạt nảy mầm và ra rễ khoảng 2 -3cm, cây con sẽ được đặt vào trong chậu đất vô trùng (3 cây/100g đất). Đất được sàng qua rây 2mm và khử trùng 2 lần ở 800C trong nồi hấp trước khi sử dụng. Bào tử AM được nhiễm vào hệ rễ của cây chủ với 10 bào tử/chậu. Xác định các chỉ tiêu sinh trưởng của cây chủ và sự thiết lập quan hệ cộng sinh của nấm rễ trên cây sau 30 ngày xử lý nấm rễ ở 250C; 12h sáng/ngày.
Các chỉ tiêu theo dõi gồm: chiều cao cây, chiều dài rễ, trọng lượng thân tươi, trọng lượng rễ tươi.
Tỷ lệ xâm nhiễm của nấm rễ vào rễ cây chủ được xác định theo phương pháp phóng đại ô giao nhau của McGonigle (1990) và đếm số lượng bào tử tạo thành từ thí nghiệm chậu vại theo phương pháp sàng ướt cải tiến.
Rễ cây được làm sạch, nhuộm bằng Trypan blue sau đó đem soi dưới kính hiển vi, tiêu bản đặt trên lam kính chia ô kích thước 1mm, đếm chiều dài rễ có cấu trúc AM và tổng chiều dài rễ, sau đó tính ra phần trăm xâm nhiễm.
3.5.7. Phương pháp phân tích các tính chất (vật lý, hóa học, sinh học) của chất nền chất nền
Các chỉ tiêu (vi sinh vật, Cacbon hữu cơ tổng số, Nitơ tổng số, Photpho tổng số, Kali tổng số, pHH20, độ ẩm) của các nguyên liệu được lựa chọn làm chất nền được xác định bằng các phương pháp thông dụng trong phòng thí nghiệm
+ Các chỉ tiêu vi sinh: được xác định theo phương pháp pha loãng Koch và tính số lượng tế bào bằng cách đếm số khuẩn lạc tạo thành khi nuôi cấy trên môi trường chuyên tính bán rắn.
+ Xác định Cacbon hữu cơ tổng số: TCVN 6644:2000 – phương pháp Walkley & Black.
+ Xác định Nitơ tổng số: TCVN 6498: 1999 – phương pháp Kjendahl. + Xác định Photpho tổng số: TCVN 4052: 1985 – phương pháp so màu xanh Molipden.
+ Xác định Kali tổng số TCVN 4053: 1985 – phương pháp quang kế ngọn lửa. + Xác định pH: TCVN 4402: 1987 – đo bằng pH
+ Xác định độ ẩm: TCVN 1867: 2001 – phương pháp sấy khô. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.5.8. Phương pháp xác định tỷ lệ nảy mầm của hạt giống
Hạt giống được nảy mầm trong điều kiện vô trùng: lấy ngẫu nhiên mỗi loại hạt giống 100 hạt (lặp lại 3 lần), khử trùng bằng cồn etanol 950 trong 1 phút, bằng dung dịch NaHClO 5% trong 1 phút (3 lần), rửa lại nhiều lần bằng nước vô trùng, ngâm nước khoảng 600C trong 2 giờ. Cuối cùng cho nảy mầm trên giấy lọc ẩm trong đĩa petri vô trùng ở 250C, đặt trong tủ định ôn.
Tỷ lệ hạt nảy mầm = (số hạt nảy mầm/tổng số hạt đem gieo)× 100%
Theo dõi sự nảy mầm của hạt giống trong thời gian 7 ngày với các chỉ tiêu theo dõi là thời gian nảy mầm, tỷ lệ nảy mầm và chiều dài rễ.
3.5.9. Phương pháp đánh giá hiệu quả tái tạo thảm cỏ của vật liệu sinh học
- Thí nghiệm đồng ruộng đánh giá hiệu quả của vật liệu sinh học với việc tái tạo thảm thực vật gồm 2 công thức với 3 lần lặp lại được bố trí theo khối ngẫu nhiên, diện tích mỗi ô thí nghiệm là 1m2.
Trong đó:
CT1 – Đối chứng (ĐC): gieo hạt và bổ sung dinh dưỡng tương ứng có trong vật liệu sinh học.
CT2 – Vật liệu sinh học (VLSH): Gieo hạt và bổ sung vật liệu sinh học (VLSH).
Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu quả của vật liệu sinh học
1m 1m 1m
Các chỉ tiêu theo dõi: chiều dài thân và rễ cây; trọng lượng thân và rễ cây; chỉ số diện tích lá (LAI) được xác định bằng cách cân đo trực tiếp.
Tính tỷ lệ che phủ: Độ che phủ của cây bụi, thảm tươi được xác định bằng tỷ lệ phần trăm giữa diện tích chiếm chỗ của cây bụi, thảm tươi và diện tích điều tra của đất. Xác định tỷ lệ che phủ thông qua chỉ số diện tích lá (LAI).
Kết quả thí nghiệm được xử lý thống kê bằng chương trình IRRISTAT.
CT1 CT2 CT2
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. TUYỂN CHỌN GIỐNG ARBUSCULAR MYCORRHIZAE,
RHIZOBIUM VÀ NHÂN GIỐNG DÙNG CHO SẢN XUẤT 4.1.1. Tuyển chọn giống Arbuscular mycorrhizae
Việc tuyển chọn giống Arbuscular mycorrhizae dựa trên 13 chủng nấm rễ bản địa được phân lập trực tiếp từ đất vùng rễ của một số cây họ hòa thảo (cây cỏ mần trầu, cây cỏ đuôi phụng) khảo sát trên đất phù sa cũ (lấy tại thị trấn Trâu Quỳ, huyện Gia Lâm, Hà Nội) và đất bạc màu (Hiệp Hòa, Bắc Giang).
Trong đó, 4 giống AM được đánh giá tốt đã được nghiên cứu chuyên sâu và 2 chủng AM có đặc tính sinh học vượt trội nhất đã được tuyển chọn để sản xuất VLSH.
Hai chủng nấm rễ được chọn là: Gigaspora sp6 (AM9) và Dentiscutata
nigra (AM10) (theo hệ thống phân loại của Morton). Đặc tính sinh học của hai
giống này được thể hiện trong bảng 4.1.
Bảng 4.1. Đặc tính của các chủng giống AM được tuyển chọn
Ký hiệu giống Hình dạng Màu sắc bào tử Kích thước bào tử (µm) Số lượng bào tử/ 100g đất Mức độ xâm nhiễm rễ (%) Tỷ lệ nảy mầm (%) Phân loại AM9 Hình cầu, gần hình cầu, một số thuôn dài Vàng sẫm 300-425 47,34 43,14 90 Gigaspora sp6 AM10 Hình cầu, gần hình cầu Kem nhạt tới vàng nâu, chuyển sang đen
240-320 34,00 38,26 80 Dentiscutata
nigra
Kết quả bảng 4.1 cho thấy: Hai chủng được tuyển chọn là AM9 và AM10 là những chủng có tỷ lệ nảy mầm cao (đạt 80-90%), có khả năng xâm nhiễm rễ lớn (38,26% - 43,14%), cho hiệu quả vượt trội trên cây chủ và được xác định thuộc giống Gigaspora sp6 và Dentiscutata nigra.
Kết quả nghiên cứu này có sự sai khác so với một số các kết quả nghiên cứu trước đó về phân lập và tuyển chọn giống AM. Theo Nguyễn Thị Minh và cs. (2014) khi nghiên cứu vật liệu sinh học nhằm tái tạo thảm thực vật phủ xanh đất trống đồi núi trọc hai chủng AM có đặc tính sinh học cao đó là: Gigaspora
sp2 và Glomus sp2. Sự sai khác này có thể là do các chủng nấm rễ AM đã thích (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});