Giống Rhizobium Màu sắc YMA-BT pH thích ứng Khả năng kháng kháng sinh (mg/l) Khả năng thích ứng to (oC) Thời gian mọc (h) Phân loại RT1 Vàng 6÷8 300÷800 25÷35 72 Nhóm2 (Bradyrhizobium japonicum ASS3) RĐ5 Xanh 5÷8 300÷1000 20÷35 48 Nhóm1 (Shinorhizobium fredii DSM5) Kết quả bảng 4.3 chỉ rõ:
Hai giống Rhizobium được lựa chọn đều có khả năng mọc nhanh (48- 72h), thích ứng ở pH và nhiệt độ rộng, ưa ấm và khả năng cạnh tranh cao (đạt 800-1.000 mg streptomicin/L mơi trường)
Kết quả này có điểm sai khác so với kết quả của một số đề tài nghiên cứu khác như “phân lập tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố định đạm nội sinh trong rễ cây ngô tại một số địa điểm của tỉnh Dak Lak” (Lê Xuân Cường, 2013). Điều này xuất hiện là do các chủng vi khuẩn Rhizobium được phân lập trên các
môi trường khác nhau và trên các cây chủ khác nhau. Cụ thể hai giống Rhizobium Bradyrhizobium japonicum ASS3 và Shinorhizobium fredii DSM5
được phân lập từ rễ cây đậu tương và rễ cây lạc trồng trên đất phù sa sơng Hồng có pH nằm trong khoảng trung tính, cịn 31 chủng Rhizobium được tác giả Lê Xuân Cường phân lập từ rễ cây ngô trong giai đoạn trổ cờ ở các nền đất khác nhau thuộc các huyện Ea Súp, Krong Năng, thành phố Buôn Mê Thuột tỉnh Đắk Lắk trong đó chọn ra được 9 chủng có đặc tính sinh trưởng mạnh.
4.1.4. Xác định các điều kiện nhân sinh khối giống Rhizobium
- Ảnh hưởng của pH
Mỗi chủng giống vi sinh vật chỉ sinh trưởng và phát triển tối ưu ở một khoảng pH nhất định cho nên sự thay đổi pH của mơi trường ni cấy trong q trình lên men nhân sinh khối sẽ có những ảnh hưởng tiêu cực đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng vi sinh vật đó. Do vậy, việc xác định được pH môi trường tối ưu cho hai chủng Rhizobium đang nghiên cứu là cần thiết.
Kết quả đánh giá ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng Rhizobium được thể hiện qua bảng 4.4
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng Rhizobium
STT Chủng VSV
Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng của các chủng Rhizobium (CFU/ml x108) pH = 4 pH = 5 pH = 6 pH = 7 pH = 8 1 Bradyrhizobium japonicum ASS3 3,1 7,9 16,7 17,4 5,6 2 Shinorhizobium fredii DSM5 3,2 6,3 17,5 17,9 6,1
Số liệu bảng 4.4 cho thấy: Các chủng Rhizobium lựa chọn có khả năng sinh trưởng và phát triển trong môi trường ni cấy có pH dao động trong khoảng 4,0 – 8,0. Tuy nhiên, khả năng sinh trưởng và phát triển chúng ở các điều kiện pH mơi trường khác nhau có sự biến động khá rõ rệt.
Trong đó, ở cả 2 chủng Rhizobium đều có mật độ cao ở khoảng pH là 6-7 đặc biệt khi pH = 7 mật độ vi sinh vật đạt mức cao nhất, nếu nuôi cấy trong mơi trường có pH lớn hơn hoặc nhỏ hơn thì mật độ tế bào của chúng đều giảm, do đó có thể lên men nhân sinh khối 2 chủng này trong điều kiện pH = 7.
- Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ là yếu tố quan trọng có ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật và hiệu quả của q trình lên men nhân sinh khối. Vì mỗi lồi vi sinh vật đều có một mức nhiệt độ tối ưu khác nhau để sinh trưởng và phát triển.
Để xác định được nhiệt độ tối ưu cho quá trình lên men nhân sinh khối, tiến hành đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng Rhizobium. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.5.
Bảng 4.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng Rhizobium
STT Tên chủng giống VSV
Số lượng khuẩn lạc (CFU/ml x108)
20oC 28 oC 30 oC 35oC 40oC
1 Bradyrhizobium
japonicum ASS3 3,0 14,2 16,05 5,6 3,2
2 Shinorhizobium
fredii DSM5 3,3 13,5 14,0 4,2 2,9
Số liệu bảng 4.5 cho thấy:
Nhiệt độ ni cấy có ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn lựa chọn, ở các khoảng nhiệt độ khác nhau thì mật độ tế bào của các chủng cũng khác nhau. Các chủng vi khuẩn này có khả năng sinh trưởng và phát triển trong khoảng nhiệt độ từ 20-400C, tuy nhiên khoảng nhiệt độ thích hợp nhất cho các chủng này sinh trưởng phát triển nằm trong khoảng từ 28- 300C. Trong khoảng nhiệt độ nuôi cấy này, mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn lựa chọn đều đạt mật độ cao nhất (đạt 13,5 ÷ 16,05 x 108 CFU/ml). Ở các nhiệt độ ngồi khoảng này thì các chủng Rhizobium sinh trưởng phát triển kém hơn, mật độ tế bào đều giảm. Trong khoảng nhiệt độ từ 28- 300C thì mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn này sinh trưởng phát triển tốt và ổn định nhất ở 300C.
Như vậy, khoảng nhiệt độ tối ưu cho quá trình lên men nhân sinh khối của các chủng Rhizobium được lựa chọn là 300C.
- Ảnh hưởng của tốc độ sục khí
Tiến hành nhân sinh khối cần phải xác định được nhu cầu oxy thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của chủng giống vi sinh vật nghiên cứu.
Để xác định được tốc độ sục khí thích hợp cho q trình lên men nhân sinh khối, 2 chủng Bradyrhizobium japonicum và Shinorhizobium fredii lựa chọn
được lên men nhân sinh khối ở các mức khơng khí được sục vào lần lượt là 0,60; 0,65; 0,70; 0,75; 0,80; 0,85 lít khơng khí/lít mơi trường/phút. Các yếu tố khác không thay đổi, với pH = 7,0; nhiệt độ 300C; tốc độ cánh khuấy 350 vòng/phút. Kết quả nghiên cứu xác định tốc độ sục khí thích hợp cho q trình lên men nhân sinh khối các chủng vi khuẩn lựa chọn được tổng hợp trong bảng 4.7.
Bảng 4.6. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí đến mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
STT
Ký hiệu chủng
Mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn với các tốc độ sục khí (CFU/ml x108) 0,60 0,65 0,70 0,75 0,80 0,85 1 Bradyrhizobium japonicum ASS3 0,581 61,34 79,2 87,2 7,976 4,78 2 Shinorhizobium fredii DSM5 0,259 80,26 62,83 7,26 4,591 0,372
Ghi chú: tốc độ sục khí: lít khơng khí/lít mơi trường/phút
Kết quả bảng 4.6 cho thấy, các chủng vi khuẩn Rhizobium tuyển chọn đều có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt với lượng khơng khí cung cấp vào q trình lên men dao động từ 0,65 - 0,75 lít khơng khí/lít mơi trường/phút. Chủng
Bradyrhizobium japonicum sinh trưởng và phát triển tốt nhất khi lượng khơng khí cung cấp đạt 0,75 lít/lít mơi trường /phút, với lượng khơng khí này thì mật độ tế bào đạt 87,2 x 108 CFU/ml. Shinorhizobium fredii sinh trưởng và phát triển tốt nhất khi lượng khơng khí cung cấp đạt 0,65 lít/lít mơi trường /phút, với lượng khơng khí này thì mật độ tế bào đạt 80,26 x 108 CFU/ml.
Như vậy, các chủng Rhizobium tuyển chọn có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt nhất trong q trình lên men khi lượng khơng khí cung cấp vào nằm trong khoảng 0,65 - 0,75 lít/lít mơi trường /phút và trong khoảng này sự sai khác khơng đáng kể vì vậy lượng khí cấp cho nhân sinh khối giống Rhizobium được lựa chọn là 0,7 lít/ lít mơi trường/phút.
- Ảnh hưởng của tốc độ cánh khuấy
Tốc độ cánh khuấy ảnh hưởng đến diện tích tiếp xúc giữa tế bào và mơi trường dinh dưỡng, phân tán đều khơng khí vào mơi trường dinh dưỡng và có tác dụng ngăn cản sự kết lắng của tế bào. Do đó, nó ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật trong quá trình lên men.
Để xác định được tốc độ cánh khuấy thích hợp cho quá trình lên men nhân sinh khối, các chủng vi khuẩn lựa chọn được lên men nhân sinh khối ở tốc độ cánh khuấy lần lượt là 200; 250; 300; 350; 400 vịng/phút. Các yếu tố khác khơng thay đổi, với pH = 7,0; nhiệt độ 300C; tốc độ sục khí 0,7 lít khơng khí/lít mơi trường /phút. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của tốc độ cánh khuấy đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn lựa chọn được tổng hợp trong bảng 4.7.
Bảng 4.7. Ảnh hưởng của tốc độ cánh khuấy đến mật độ tế bào của các chủng Rhizobium
STT Ký hiệu chủng
Mật độ tế bào của Rhizobium tại các tốc độ cánh khuấy (CFU/ml x 108) 200 250 300 350 400 1 Bradyrhizobium japonicum ASS3 0,302 73,46 69,37 4,23 1,801 2 Shinorhizobium fredii DSM5 0,542 12,50 83,16 4,49 0,366 Ghi chú: Tốc độ cánh khuấy: vòng/phút
Qua bảng số liệu nhận thấy: Mật độ tế bào của vi khuẩn Rhizobium đạt tối đa trong khoảng tốc độ cánh khuấy từ 250 – 300 vịng/phút. Trong đó, mật độ tế bào của chủng Bradyrhizobium japonicum đạt cao nhất (73,46 x 108 CFU/ml) khi tốc độ cánh khuấy trong quá trình lên men là 250 vòng/phút. Mật độ tế bào của chủng Shinorhizobium fredii đạt cao nhất (83,16 x 108 CFU/ml) khi tốc độ cánh khuấy trong quá trình lên men là 300 vòng/phút.
Ở các tốc độ khuấy thấp hơn hoặc cao hơn thì mật độ các chủng Rhizobium được lựa chọn là thấp do ở tốc độ khuấy thấp lượng oxy hịa tan trong mơi trường không đủ cung cấp cho vi sinh vật, các tế bào có sự kết lắng lại với nhau; ở tốc độ khuấy cao thì sự hấp thụ các chất dinh dưỡng của vi sinh vật bị cản trở.
Như vậy, điều kiện nhân sinh khối của hai chủng Rhizobium
Bradyrhizobium japonicum và Shinorhizobium fredii được tiến hành với tốc độ khuấy lần lượt là 250 và 300 vòng/phút.
- Tỷ lệ giống cấp 2
Trong quá trình lên men nhân sinh khối ngồi các yếu tố về dinh dưỡng, điều kiện ni cấy thì lượng giống cấp một bổ sung vào q trình lên men cũng hết sức quan trọng, nó quyết định chất lượng và giá cả của vật liệu sinh học tạo thành. Vì vậy, việc nghiên cứu đưa ra một tỷ lệ giống cấp 2 thích hợp trong quá trình lên men là rất cần thiết.
Kết quả xác định tỷ lệ giống cấp 2 thích hợp cho quá trình lên men nhân sinh khối các chủng vi khuẩn lựa chọn được tổng hợp trong bảng 4.9.
Bảng 4.8. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấp 2 đến mật độ tế bào của các chủng Rhizobium
STT Ký hiệu
chủng
Mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn tương ứng với tỷ lệ giống cấp 2 (CFU/ml x109) 1 (%) 2 (%) 3 (%) 5 (%) 10 (%) 1 Bradyrhizobium japonicum ASS3 0,52 2,16 4,75 5,01 4,15 2 Shinorhizobium fredii DSM5 0,38 2,10 4,59 4,76 3,84
Kết quả bảng 4.9 cho thấy, với các tỷ lệ giống cấp 2 khác nhau thì mật độ tế bào của các chủng cũng có sự khác nhau. Ở cả hai chủng, khi lượng giống cấp 1 bổ sung vào là 5% thì mật độ tế bào đều đạt cao nhất. Tuy nhiên, với lượng giống cấp 2 bổ sung vào là 5% thì mật độ tế bào đạt được cũng không cao hơn nhiều so với khi bổ sung 3%. Do đó, để tiết kiệm chi phí sản xuất thì lượng giống cấp 2 bổ sung vào cho quá trình lên men các chủng vi khuẩn lựa chọn là 3%.
Tổng hợp các điều kiện tối ưu để nhân giống Rhizobium được tuyển chọn được trình bày ở bảng 4.9.