- Thí nghiệm đồng ruộng đánh giá hiệu quả của vật liệu sinh học với việc tái tạo thảm thực vật gồm 2 công thức với 3 lần lặp lại được bố trí theo khối ngẫu nhiên, diện tích mỗi ô thí nghiệm là 1m2.
Trong đó:
CT1 – Đối chứng (ĐC): gieo hạt và bổ sung dinh dưỡng tương ứng có trong vật liệu sinh học.
CT2 – Vật liệu sinh học (VLSH): Gieo hạt và bổ sung vật liệu sinh học (VLSH).
Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu quả của vật liệu sinh học
1m 1m 1m
Các chỉ tiêu theo dõi: chiều dài thân và rễ cây; trọng lượng thân và rễ cây; chỉ số diện tích lá (LAI) được xác định bằng cách cân đo trực tiếp.
Tính tỷ lệ che phủ: Độ che phủ của cây bụi, thảm tươi được xác định bằng tỷ lệ phần trăm giữa diện tích chiếm chỗ của cây bụi, thảm tươi và diện tích điều tra của đất. Xác định tỷ lệ che phủ thông qua chỉ số diện tích lá (LAI).
Kết quả thí nghiệm được xử lý thống kê bằng chương trình IRRISTAT.
CT1 CT2 CT2
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. TUYỂN CHỌN GIỐNG ARBUSCULAR MYCORRHIZAE,
RHIZOBIUM VÀ NHÂN GIỐNG DÙNG CHO SẢN XUẤT 4.1.1. Tuyển chọn giống Arbuscular mycorrhizae
Việc tuyển chọn giống Arbuscular mycorrhizae dựa trên 13 chủng nấm rễ bản địa được phân lập trực tiếp từ đất vùng rễ của một số cây họ hòa thảo (cây cỏ mần trầu, cây cỏ đuôi phụng) khảo sát trên đất phù sa cũ (lấy tại thị trấn Trâu Quỳ, huyện Gia Lâm, Hà Nội) và đất bạc màu (Hiệp Hòa, Bắc Giang).
Trong đó, 4 giống AM được đánh giá tốt đã được nghiên cứu chuyên sâu và 2 chủng AM có đặc tính sinh học vượt trội nhất đã được tuyển chọn để sản xuất VLSH.
Hai chủng nấm rễ được chọn là: Gigaspora sp6 (AM9) và Dentiscutata
nigra (AM10) (theo hệ thống phân loại của Morton). Đặc tính sinh học của hai
giống này được thể hiện trong bảng 4.1.
Bảng 4.1. Đặc tính của các chủng giống AM được tuyển chọn
Ký hiệu giống Hình dạng Màu sắc bào tử Kích thước bào tử (µm) Số lượng bào tử/ 100g đất Mức độ xâm nhiễm rễ (%) Tỷ lệ nảy mầm (%) Phân loại AM9 Hình cầu, gần hình cầu, một số thuôn dài Vàng sẫm 300-425 47,34 43,14 90 Gigaspora sp6 AM10 Hình cầu, gần hình cầu Kem nhạt tới vàng nâu, chuyển sang đen
240-320 34,00 38,26 80 Dentiscutata
nigra
Kết quả bảng 4.1 cho thấy: Hai chủng được tuyển chọn là AM9 và AM10 là những chủng có tỷ lệ nảy mầm cao (đạt 80-90%), có khả năng xâm nhiễm rễ lớn (38,26% - 43,14%), cho hiệu quả vượt trội trên cây chủ và được xác định thuộc giống Gigaspora sp6 và Dentiscutata nigra.
Kết quả nghiên cứu này có sự sai khác so với một số các kết quả nghiên cứu trước đó về phân lập và tuyển chọn giống AM. Theo Nguyễn Thị Minh và cs. (2014) khi nghiên cứu vật liệu sinh học nhằm tái tạo thảm thực vật phủ xanh đất trống đồi núi trọc hai chủng AM có đặc tính sinh học cao đó là: Gigaspora
sp2 và Glomus sp2. Sự sai khác này có thể là do các chủng nấm rễ AM đã thích nghi với từng loại môi trường sinh thái, cụ thể ở đây hai chủng Gigaspora sp6 và
Dentiscutata nigra là hai chủng có đặc tính sinh học ưu thế hơn do phổ thích nghi của chúng phù hợp với đất phù sa cũ Gia Lâm và cả đất bạc màu hơn so với các chủng khác.
4.1.2. Lựa chọn cây chủ để nhân giống nấm rễ được tuyển chọn
Cây chủ thích hợp để nhân giống nấm rễ cần có thời gian sinh trưởng ngắn, bộ rễ phát triển nhanh và khỏe mạnh, có khả năng tạo sinh khối lớn và thích hợp cho AM nhằm giúp cho nấm rễ sinh trưởng, phát triển tốt và nhân lên nhanh chóng.
Loại cây được lựa chọn để nhân giống nấm rễ bao gồm cây đậu xanh (Vigna radiata), cây cỏ mần trầu (Eleusine indica (L.) Gaertn) và cây cỏ đuôi phụng (Paspalum). Kết quả theo dõi một số chỉ tiêu sinh trưởng của cây và sự cộng sinh của AM được thể hiện ở bảng 4.2.
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của các chủng nấm rễ đến sinh trưởng của cây chủ (sau 30 ngày trồng) Chỉ Tiêu Công thức Chiều cao cây Chiều dài rễ Trọng lượng thân Trọng lượng rễ Mức độ xâm nhiễm rễ Số lượng bào tử
cm cm g/cây g/cây % theo (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
chiều dài rễ Bào tử/ 100g đất 1. Đậu xanh (ĐX) 15,42 11,04 1,24 0,17 1,6 4,2 ĐX nhiễm AM9 20,10 14,23 1,62 0,28 23,19 28,16 ĐX nhiễm AM10 19,34 13,87 1,48 0,21 18,41 24,00 2. Cỏ đuôi phụng (ĐP) 17,51 14,96 0,57 0,12 1,51 1,72 ĐP nhiễm AM9 30,12 22,08 2,90 0,61 17,65 26,17 ĐP nhiễm AM10 23,76 19,73 2,57 0,20 16,79 21,13 3. Cỏ mần trầu (MT) 5,60 4,01 0,31 0,21 0,03 0,43 SL nhiễm AM9 6,35 4,68 0,49 0,07 3,09 12,61 SL nhiễm AM10 5,84 4,32 0,40 0,03 2,05 11,95 Các giá trị sinh trưởng của cây đạt cao nhất ở cây cỏ đuôi phụng khi xử lý nhiễm AM9 và thấp nhất ở cây cỏ mần trầu khi xử lý AM10.
trưởng phát triển ở cây chủ, riêng với cỏ mần trầu việc xử lý AM gần như không đem lại hiệu quả rõ rệt ở các chỉ tiêu theo dõi. Do vậy, hai giống đậu xanh và cỏ đuôi phụng được lựa chọn làm cây chủ để nhân giống hai chủng nấm rễ đã được tuyển chọn. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả nghiên cứu của Nông Thị Quỳnh Anh (2014) khi nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vật liệu sinh học từ nấm rễ nội cộng sinh Arbuscular mycorhizae nhằm tái tạo thảm thực vật phủ xanh đất trống đồi núi trọc.
4.1.3. Tuyển chọn giống Rhizobium
Từ 15 mẫu rễ của 3 loại cây (điền thanh, đậu tương, lạc) trên đất phù sa Sông Hồng đã phân lập được 24 chủng Rhizobium. Khả năng cộng sinh của Rhizobium được đánh giá thông qua xử lý trực tiếp giống vi khuẩn cho hạt đậu xanh. Từ đó, 10 giống Rhizobium có khả năng cộng sinh tốt đã được nghiên cứu chuyên sâu và chọn ra 2 giống Rhizobium có đặc tính sinh học vượt trội nhất để sản xuất VLSH cùng với AM.
Bảng 4.3. Đặc tính của các chủng giống Rhizobium được tuyển chọn
Giống Rhizobium Màu sắc YMA-BT pH thích ứng Khả năng kháng kháng sinh (mg/l) Khả năng thích ứng to (oC) Thời gian mọc (h) Phân loại RT1 Vàng 6÷8 300÷800 25÷35 72 Nhóm2 (Bradyrhizobium japonicum ASS3) RĐ5 Xanh 5÷8 300÷1000 20÷35 48 Nhóm1 (Shinorhizobium fredii DSM5) Kết quả bảng 4.3 chỉ rõ:
Hai giống Rhizobium được lựa chọn đều có khả năng mọc nhanh (48- 72h), thích ứng ở pH và nhiệt độ rộng, ưa ấm và khả năng cạnh tranh cao (đạt 800-1.000 mg streptomicin/L môi trường)
Kết quả này có điểm sai khác so với kết quả của một số đề tài nghiên cứu khác như “phân lập tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố định đạm nội sinh trong rễ cây ngô tại một số địa điểm của tỉnh Dak Lak” (Lê Xuân Cường, 2013). Điều này xuất hiện là do các chủng vi khuẩn Rhizobium được phân lập trên các
môi trường khác nhau và trên các cây chủ khác nhau. Cụ thể hai giống Rhizobium Bradyrhizobium japonicum ASS3 và Shinorhizobium fredii DSM5
được phân lập từ rễ cây đậu tương và rễ cây lạc trồng trên đất phù sa sông Hồng có pH nằm trong khoảng trung tính, còn 31 chủng Rhizobium được tác giả Lê Xuân Cường phân lập từ rễ cây ngô trong giai đoạn trổ cờ ở các nền đất khác nhau thuộc các huyện Ea Súp, Krong Năng, thành phố Buôn Mê Thuột tỉnh Đắk Lắk trong đó chọn ra được 9 chủng có đặc tính sinh trưởng mạnh.
4.1.4. Xác định các điều kiện nhân sinh khối giống Rhizobium
- Ảnh hưởng của pH
Mỗi chủng giống vi sinh vật chỉ sinh trưởng và phát triển tối ưu ở một khoảng pH nhất định cho nên sự thay đổi pH của môi trường nuôi cấy trong quá trình lên men nhân sinh khối sẽ có những ảnh hưởng tiêu cực đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng vi sinh vật đó. Do vậy, việc xác định được pH môi trường tối ưu cho hai chủng Rhizobium đang nghiên cứu là cần thiết.
Kết quả đánh giá ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng Rhizobium được thể hiện qua bảng 4.4
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng Rhizobium
STT Chủng VSV
Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng của các chủng Rhizobium (CFU/ml x108) pH = 4 pH = 5 pH = 6 pH = 7 pH = 8 1 Bradyrhizobium japonicum ASS3 3,1 7,9 16,7 17,4 5,6 2 Shinorhizobium fredii DSM5 3,2 6,3 17,5 17,9 6,1
Số liệu bảng 4.4 cho thấy: Các chủng Rhizobium lựa chọn có khả năng sinh trưởng và phát triển trong môi trường nuôi cấy có pH dao động trong khoảng 4,0 – 8,0. Tuy nhiên, khả năng sinh trưởng và phát triển chúng ở các điều kiện pH môi trường khác nhau có sự biến động khá rõ rệt.
Trong đó, ở cả 2 chủng Rhizobium đều có mật độ cao ở khoảng pH là 6-7 đặc biệt khi pH = 7 mật độ vi sinh vật đạt mức cao nhất, nếu nuôi cấy trong môi trường có pH lớn hơn hoặc nhỏ hơn thì mật độ tế bào của chúng đều giảm, do đó có thể lên men nhân sinh khối 2 chủng này trong điều kiện pH = 7.
- Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ là yếu tố quan trọng có ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật và hiệu quả của quá trình lên men nhân sinh khối. Vì mỗi loài vi sinh vật đều có một mức nhiệt độ tối ưu khác nhau để sinh trưởng và phát triển.
Để xác định được nhiệt độ tối ưu cho quá trình lên men nhân sinh khối, tiến hành đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng Rhizobium. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.5.
Bảng 4.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng Rhizobium
STT Tên chủng giống VSV
Số lượng khuẩn lạc (CFU/ml x108) 20oC 28 oC 30 oC 35oC 40oC
1 Bradyrhizobium
japonicum ASS3 3,0 14,2 16,05 5,6 3,2
2 Shinorhizobium
fredii DSM5 3,3 13,5 14,0 4,2 2,9
Số liệu bảng 4.5 cho thấy: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhiệt độ nuôi cấy có ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn lựa chọn, ở các khoảng nhiệt độ khác nhau thì mật độ tế bào của các chủng cũng khác nhau. Các chủng vi khuẩn này có khả năng sinh trưởng và phát triển trong khoảng nhiệt độ từ 20-400C, tuy nhiên khoảng nhiệt độ thích hợp nhất cho các chủng này sinh trưởng phát triển nằm trong khoảng từ 28- 300C. Trong khoảng nhiệt độ nuôi cấy này, mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn lựa chọn đều đạt mật độ cao nhất (đạt 13,5 ÷ 16,05 x 108 CFU/ml). Ở các nhiệt độ ngoài khoảng này thì các chủng Rhizobium sinh trưởng phát triển kém hơn, mật độ tế bào đều giảm. Trong khoảng nhiệt độ từ 28- 300C thì mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn này sinh trưởng phát triển tốt và ổn định nhất ở 300C.
Như vậy, khoảng nhiệt độ tối ưu cho quá trình lên men nhân sinh khối của các chủng Rhizobium được lựa chọn là 300C.
- Ảnh hưởng của tốc độ sục khí
Tiến hành nhân sinh khối cần phải xác định được nhu cầu oxy thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của chủng giống vi sinh vật nghiên cứu.
Để xác định được tốc độ sục khí thích hợp cho quá trình lên men nhân sinh khối, 2 chủng Bradyrhizobium japonicum và Shinorhizobium fredii lựa chọn
được lên men nhân sinh khối ở các mức không khí được sục vào lần lượt là 0,60; 0,65; 0,70; 0,75; 0,80; 0,85 lít không khí/lít môi trường/phút. Các yếu tố khác không thay đổi, với pH = 7,0; nhiệt độ 300C; tốc độ cánh khuấy 350 vòng/phút. Kết quả nghiên cứu xác định tốc độ sục khí thích hợp cho quá trình lên men nhân sinh khối các chủng vi khuẩn lựa chọn được tổng hợp trong bảng 4.7.
Bảng 4.6. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí đến mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
STT
Ký hiệu chủng
Mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn với các tốc độ sục khí (CFU/ml x108) 0,60 0,65 0,70 0,75 0,80 0,85 1 Bradyrhizobium japonicum ASS3 0,581 61,34 79,2 87,2 7,976 4,78 2 Shinorhizobium fredii DSM5 0,259 80,26 62,83 7,26 4,591 0,372
Ghi chú: tốc độ sục khí: lít không khí/lít môi trường/phút
Kết quả bảng 4.6 cho thấy, các chủng vi khuẩn Rhizobium tuyển chọn đều có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt với lượng không khí cung cấp vào quá trình lên men dao động từ 0,65 - 0,75 lít không khí/lít môi trường/phút. Chủng
Bradyrhizobium japonicum sinh trưởng và phát triển tốt nhất khi lượng không khí cung cấp đạt 0,75 lít/lít môi trường /phút, với lượng không khí này thì mật độ tế bào đạt 87,2 x 108 CFU/ml. Shinorhizobium fredii sinh trưởng và phát triển tốt nhất khi lượng không khí cung cấp đạt 0,65 lít/lít môi trường /phút, với lượng không khí này thì mật độ tế bào đạt 80,26 x 108 CFU/ml.
Như vậy, các chủng Rhizobium tuyển chọn có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt nhất trong quá trình lên men khi lượng không khí cung cấp vào nằm trong khoảng 0,65 - 0,75 lít/lít môi trường /phút và trong khoảng này sự sai khác không đáng kể vì vậy lượng khí cấp cho nhân sinh khối giống Rhizobium được lựa chọn là 0,7 lít/ lít môi trường/phút.
- Ảnh hưởng của tốc độ cánh khuấy
Tốc độ cánh khuấy ảnh hưởng đến diện tích tiếp xúc giữa tế bào và môi trường dinh dưỡng, phân tán đều không khí vào môi trường dinh dưỡng và có tác dụng ngăn cản sự kết lắng của tế bào. Do đó, nó ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật trong quá trình lên men.
Để xác định được tốc độ cánh khuấy thích hợp cho quá trình lên men nhân sinh khối, các chủng vi khuẩn lựa chọn được lên men nhân sinh khối ở tốc độ cánh khuấy lần lượt là 200; 250; 300; 350; 400 vòng/phút. Các yếu tố khác không thay đổi, với pH = 7,0; nhiệt độ 300C; tốc độ sục khí 0,7 lít không khí/lít môi trường /phút. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của tốc độ cánh khuấy đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn lựa chọn được tổng hợp trong bảng 4.7.
Bảng 4.7. Ảnh hưởng của tốc độ cánh khuấy đến mật độ tế bào của các chủng Rhizobium
STT Ký hiệu chủng
Mật độ tế bào của Rhizobium tại các tốc độ cánh khuấy (CFU/ml x 108) 200 250 300 350 400 1 Bradyrhizobium japonicum ASS3 0,302 73,46 69,37 4,23 1,801 2 Shinorhizobium fredii DSM5 0,542 12,50 83,16 4,49 0,366 Ghi chú: Tốc độ cánh khuấy: vòng/phút
Qua bảng số liệu nhận thấy: Mật độ tế bào của vi khuẩn Rhizobium đạt tối đa trong khoảng tốc độ cánh khuấy từ 250 – 300 vòng/phút. Trong đó, mật độ tế bào của chủng Bradyrhizobium japonicum đạt cao nhất (73,46 x 108 CFU/ml) khi tốc độ cánh khuấy trong quá trình lên men là 250 vòng/phút. Mật độ tế bào của chủng Shinorhizobium fredii đạt cao nhất (83,16 x 108 CFU/ml) khi tốc độ cánh khuấy trong quá trình lên men là 300 vòng/phút.
Ở các tốc độ khuấy thấp hơn hoặc cao hơn thì mật độ các chủng Rhizobium được lựa chọn là thấp do ở tốc độ khuấy thấp lượng oxy hòa tan trong môi trường không đủ cung cấp cho vi sinh vật, các tế bào có sự kết lắng lại với nhau; ở tốc độ khuấy cao thì sự hấp thụ các chất dinh dưỡng của vi sinh vật bị cản trở.
Như vậy, điều kiện nhân sinh khối của hai chủng Rhizobium
Bradyrhizobium japonicum và Shinorhizobium fredii được tiến hành với tốc độ khuấy lần lượt là 250 và 300 vòng/phút.
- Tỷ lệ giống cấp 2
Trong quá trình lên men nhân sinh khối ngoài các yếu tố về dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy thì lượng giống cấp một bổ sung vào quá trình lên men cũng hết sức quan trọng, nó quyết định chất lượng và giá cả của vật liệu sinh học tạo thành. Vì vậy, việc nghiên cứu đưa ra một tỷ lệ giống cấp 2 thích hợp trong quá trình lên men là rất cần thiết.
Kết quả xác định tỷ lệ giống cấp 2 thích hợp cho quá trình lên men nhân