Phần 3 Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các mức năng lượng và protein
protein trong khẩu phần trong mùa hè - thu và đông - xuân đến năng suất và chất lượng tinh dịch của bò đực sản xuất tinh giống Holstein Friesian nuôi tại Trạm nghiên cứu và sản xuất tinh đông lạnh Moncada
a. Bố trí thí nghiệm
Hai thí nghiệm được tiến hành vào hai thời vụ khác nhau trong năm (mùa hè - thu từ tháng 01/5 - 31/8/2016 và mùa đông - xuân từ 01/11/2016 - 28/02/2017).
Trong mùa hè - thu (từ 01/5/2016 - 31/8/2016), thí nghiệm được thực hiện trên 9 bò đực giống HF (từ 5 – 6 tuổi), khối lượng cơ thể trung bình 1035,8 kg, đồng đều về năng suất và chất lượng tinh. Thí nghiệm được thiết kế theo phương pháp khối ngẫu nhiên hoàn toàn, theo đó, bò đực giống được phân ngẫu nhiên vào 3 lô, mỗi lô 3 con, mỗi con được coi như một đơn vị thí nghiệm, đồng thời là một lần lặp lại.
Trong mùa đông - xuân (từ 01/11/2016 - 28/02/2017) thí nghiệm được thực hiện trên 9 bò đực giống HF (từ 5 – 6 tuổi), khối lượng cơ thể trung bình 1035,9 kg, đồng đều về năng suất và chất lượng tinh. Thí nghiệm được thiết kế theo phương pháp ngẫu nhiên hoàn toàn, theo đó, bò đực giống được phân ngẫu nhiên vào 3 lô, mỗi lô 3 con, mỗi con được coi như một đơn vị thí nghiệm, đồng thời là một lần lặp lại.
- Bò đực giống HF ở lô I được ăn khẩu phần (tương ứng với từng mùa) tương đương mức năng lượng trao đổi và protein thô bằng 100% theo tiêu chuẩn ăn của NRC (1988) cho bò đực giống HF trưởng thành.
- Bò đực giống HF ở lô II được ăn khẩu phần (tương ứng với từng mùa) tương đương mức năng lượng trao đổi và protein thô bằng 105% theo tiêu chuẩn ăn của NRC (1988) cho bò đực giống HF trưởng thành.
- Bò đực giống HF ở lô III được ăn khẩu phần (tương ứng với từng mùa) tương đương mức năng lượng trao đổi và protein thô bằng 110% theo tiêu chuẩn ăn của NRC (1988) cho bò đực giống HF trưởng thành.
- Khẩu phần thí nghiệm được thiết lập bằng phần mềm chuyên dụng Ultramix của trường Đại học tổng hợp Oxford (Vương quốc Anh), đảm bảo cơ cấu (tỷ lệ giữa các loại thức ăn tinh và thô) và các thành phần dinh dưỡng khác (khoáng đa, vi lượng) trong các khẩu phần ở các lô là như nhau theo NRC (1988). Sơ đồ bố trí thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Các chỉ tiêu Lô I Lô II Lô III
- Số bò thí nghiệm trong mùa hè – thu 3 3 3 - Số bò thí nghiệm trong mùa đông – xuân 3 3 3 - Yếu tố thí nghiệm
+ Mức năng lượng trao đổi và protein thô cung cấp hàng ngày 100% NRC (1988) 105% NRC (1988) 110% NRC (1988) + Các mức dinh dưỡng khác (Khoáng,
Bảng 3.3a. Khẩu phần thí nghiệm mùa hè - thu Chỉ tiêu ĐVT Mức I Chỉ tiêu ĐVT Mức I (100% NRC) Mức II (105 %NRC) Mức III (110%NRC) 1/Khẩu phần ăn Cỏ Ghinê tươi kg VCK 6,8 7,2 7,42 Cỏ Pangola khô kg VCK 3,6 3,5 3,63 Thóc mầm kg VCK 0,5 0,7 0,72 Thức ăn tinh hỗn hợp kg VCK 2,2 2,4 2,55 2/Dinh dưỡng VCK kg/con/ngày 13,1 13,7 14,3 Tổng ME MJ/con/ngày 114,8 119,8 125,2 Tổng protein thô g/con/ngày 1.371,5 1.435,9 1.501,9 Mật độ năng lượng MJ/kg VCK 8,7 8,7 8,7
Bảng 3.3b. Khẩu phần thí nghiệm mùa đông - xuân
Chỉ tiêu ĐVT Mức I (100% NRC) Mức II (105 %NRC) Mức III (110%NRC) 1/Khẩu phần ăn Cỏ Ghinê tươi kg VCK 2,9 3,1 3,2 Cỏ Pangola khô kg VCK 8,5 8,9 9,2 Thóc mầm kg VCK 0,4 0,5 0,9 Thức ăn tinh hỗn hợp kg VCK 2,5 2,6 2,9 2/Dinh dưỡng VCK kg/con/ngày 14,3 15,2 16,1 Tổng ME MJ/con/ngày 113,6 119,8 128,7 Tổng protein thô g/con/ngày 1.349,0 1.415,8 1.523,2 Mật độ năng lượng MJ/kg VCK 8,4 8,4 8,4
b. Các chỉ tiêu theo dõi
- Sự thay đổi khối lượng. - Thể trạng (mức độ béo gầy).
- Lượng thức ăn ăn vào hàng ngày của từng bò đực giống.
- Các chỉ tiêu số lượng, chất lượng tinh dịch: Thể tích tinh dịch, màu sắc, độ pH, nồng độ, hoạt lực tinh trùng, tỷ lệ tinh trùng chết, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình, hoạt lực tinh trùng sau giải đông, số lần khai thác, số lần khai thác đạt tiêu chuẩn và số tinh cọng rạ sản xuất được xác định bằng các phương pháp đã được chuẩn hóa thành tiêu, chuẩn TCVN 8925:2012.
c. Phương pháp theo dõi các chỉ tiêu nghiên cứu của thí nghiệm
- Lượng dinh dưỡng thu nhận: Lượng dinh dưỡng thu nhận được xác định hàng ngày thông qua cân tổng lượng thức ăn cho ăn (được cân bằng cân đồng hồ Nhơn Hòa loại 100kg ± 30g) và thức ăn thừa hàng ngày (được cân bằng cân kỹ thuật, khả năng chịu tải tối đa 6200g, của hãng Shimadzu) của từng cá thể trong suốt thời gian theo dõi chính thức.
* Đối với thức ăn thô xanh
Thu cắt theo nguyên tắc đường chéo ô vuông, ít nhất là 5 điểm (5 m2) trên ruộng được chọn để thu cắt mẫu, đảm bảo đồng đều.
Sau khi lấy mẫu cỏ ban đầu thì việc lấy mẫu trung bình phải tiến hành ngay và hàm lượng nước phải được xác định tức thời.
Sấy khô mẫu và nghiền mịn cho việc thực hiện các phân tích DM, CP, CF, ADF, NDF, Ash, GE, ME, DOM, Se, Zn.
* Đối với thức ăn thô khô
Cỏ thu mẫu phải được lấy ở các vị trí khác nhau trong đống, phía trên cách bề mặt không dưới 20 cm, lớp đáy cách mặt đáy > 20 cm. Mỗi lớp lấy ở nhiều vị trí trên 2 đường chéo hình chữ nhật của mặt cắt ngang mỗi lớp.
* Đối với thức ăn tinh
Lấy mẫu của 5% tổng số bao nhưng không ít hơn 3 bao. Bao được chọn ở các vị trí khác nhau trong kho, nhưng phải chọn theo hàng. Trong mỗi bao cần chọn ít nhất 3 vị trí ở 3 lớp: trên, giữa và đáy bao.
- Các nguyên liệu thức ăn tinh hỗn hợp, thức ăn thô cho ăn được lấy mẫu hàng tháng phân tích (vật chất khô, protein thô) và xác định giá trị ME.
- Thức ăn thừa được lấy mẫu hàng tuần được cân và sấy xác định hàm lượng chất khô, sau đó bảo quản trong tủ lạnh. Đến cuối đợt thí nghiệm các mẫu của từng loại thức ăn được trộn đều và 1 mẫu đại diện được lấy, gửi đi phân tích xác định vật chất khô, protein thô và năng lượng trao đổi.
- Thành phần hoá học của các thức ăn và thức ăn thừa thí nghiệm được phân tích tại phòng Phân tích thức ăn và sản phẩm chăn nuôi, Viện Chăn nuôi.
+ Độ ẩm (%) được phân tích theo TCVN: 4326:2001. + Protein thô được phân tích theo TCVN: 4328:2007.
- Phân tích Protein tổng số (CP): Theo TCVN 4328-2007. - Phân tích Xơ thô (CF): Theo TCVN 4329-2007.
- Phân tích ADF: Theo AOAC 973.18.01. - Phân tích NDF: Theo AOAC 973.18.01.
- Phân tích khoáng tổng số (Ash): Theo TCVN 4327-2007.
+ Giá trị năng lượng trao đổi (ME) được xác định dựa vào lượng khí sinh ra tại thời điểm 24h sau khi ủ, kết hợp với thành phần hóa học của khẩu phần (mẫu ủ) để ước tính giá trị năng lượng trao đổi của chúng thông qua phương trình sau:
ME (kcal/ kgDM) = 1885 + 21*GP24 + 2,49*DM – 21,6*CP (Vũ Chí Cương và cs., 2006).
Trong đó: GP24(ml) là thể tích khí trong xilanh chứa mẫu tại thời điểm 24 giờ sau ủ, DM(%) là tỷ lệ vật chất khô, CP(%) là tỷ lệ protein thô.
*Khối lượng cơ thể và thể trạng bò thí nghiệm
- Sự thay đổi khối lượng (cân bằng cân điện tử) được đánh giá 1 tháng một lần Tại mỗi lần đánh giá, bò đực giống ở các lô được cân vào buổi sáng trước khi cho ăn và lấy giá trị trung bình.
- Thể trạng (mức độ béo gầy) được đánh giá theo thang điểm từ 1 đến 9 của Đại học tổng hợp Mississippi Hoa Kỳ (Mississippi State University Extension Service, 1999).
* Phương pháp khai thác tinh dịch
- Thời gian khai thác tinh: từ 6 giờ đến 8 giờ (buổi sáng) - Tần suất khai thác tinh dịch: 2 lần/tuần
- Chuẩn bị âm đạo giả: Các bộ phận của âm đạo giả, đã được khử trùng rồi lắp ráp và bảo quản trong tủ ấm 420C trước khi lấy tinh.
- Chuẩn bị bò đực: Những bò đực đến ngày khai thác tinh được tắm sạch sẽ và thụt rửa bao dương vật trước khi khai thác tinh 30 phút bằng nước muối sinh lý 0,9%.
- Chuẩn bị bò giá: Chọn bò giá thích hợp, vệ sinh cơ thể bò sạch sẽ và cho vào giá.
- Lấy tinh: Kích thích cho bò đực giống hưng phấn sinh dục, rồi cho nhảy bò giá và lấy tinh bằng âm đạo giả.
- Mẫu tinh dịch khai thác được đưa ngay vào phòng thí nghiệm và đặt trong bể nước ấm 350C để kiểm tra các chỉ tiêu số lượng, chất lượng tinh dịch sau đó đưa những mẫu tinh dịch đạt tiêu chuẩn vào sản xuất tinh đông lạnh dạng cọng rạ. * Phương pháp xác định một số chỉ tiêu số lượng, chất lượng tinh dịch bò
- Màu sắc tinh dịch: Màu sắc tinh dịch được đánh số theo quy ước như sau:1 là tinh dịch có màu trắng trong; 2 tinh dịch có màu trắng sữa; 3 tinh dịch có màu trắng ngà; 4 tinh dịch có màu trắng đục (Sarder, 2007).
- Thể tích tinh dịch: Xác định bằng cách quan sát trên ống đong có vạch chia ml.
- Hoạt lực tinh trùng: Dùng micropipét hút 0,01 ml tinh dịch + 0,09 ml dung dịch A (môi trường pha loãng tinh dịch không có glycerol) rồi nhỏ lên phiến kính chuyên dụng và được giữ ấm ở nhiệt độ 38oC, đậy la men rồi đưa lên kính hiển vi phản pha có có gắn camera phóng đại 100 lần kết nối với màn hình. Hoạt lực tinh trùng được kiểm tra ngay sau khi khai thác tinh dịch.
- Nồng độ tinh trùng: Dùng micropipét hút 0,02ml tinh dịch pha loãng trong 4ml nước muối sinh lý 0,9%, lắc nhẹ cho đều và đưa vào máy Photometer SDM5 (Minitub, Đức). Chỉ số hiện trên máy là nồng độ tinh trùng (tỉ/ml).
- Tổng số tinh trùng sống tiến thẳng: Xác định bằng tích của lượng xuất tinh, hoạt lực tinh trùng và nồng độ tinh trùng (VAC = VxAxC).
- pH tinh dịch: Xác định bằng máy đo pH (Minitub, Đức).
- Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình: Sử dụng Fucsin 5% nhuộm tinh trùng từ 5 đến 7 phút, phết lam kính và soi trên kính hiển vi có độ phóng đại 400 lần. Đếm số lượng tinh trùng kỳ hình và không kỳ hình, tổng số 500 tinh trùng, rồi tính toán bằng phép tính số học thông thường theo công thức sau:
K (%) = Số lượng tinh trùng kỳ hình x 100 500
- Tỷ lệ tinh trùng sống (%): Xác định theo phương pháp của Blom (1950), nhỏ 1 giọt tinh dịch lên lam kính lõm và 2 giọt Eosin 5%, đảo nhẹ, sau đó nhỏ 4 giọt Nigrosin 10%, đảo nhẹ, để ấm 370C trong 30 giây. Lấy 1 giọt tinh dịch đã nhuộm phết kính dàn mỏng đều đưa lên kính hiển vi với độ phóng đại 400 lần. Đếm tổng số 500 tinh trùng gồm cả tinh trùng sống và tinh trùng chết (tinh trùng
chết là những tinh trùng bắt màu đỏ Eosin). Tính tỷ lệ tinh trùng sống bằng phép tính số học thông thường theo công thức sau:
Tỷ lệ tinh trùng sống (%) = Số lượng tinh trùng sống x 100 500
- Các chỉ tiêu số lượng tinh sản xuất như: số lần khai thác, số lần khai thác đạt tiêu chuẩn, số tinh cọng rạ sản xuất, số tinh cọng rạ đạt tiêu chuẩn cung cấp ra thị trường, được theo dõi, ghi chép sau mỗi lần khai thác và tính toán theo phương pháp số học thông thường.