3.5.1. Thiết kế thí nghiệm
Trong thực tế sản xuất, vacxin phòng bệnh do PPV (bệnh khô thai) chỉ được dùng cho lợn hậu bị và lợn nái. Do vậy, để nghiên cứu sự lưu hành huyết thanh học PPV, nghiên cứu này tập trung vào nhóm lợn thịt trong giai đoạn 40 đến 80 ngày tuổi (đối tượng không được tiêm vacxin PPV). Mẫu được lấy ở các hộ chăn nuôi với quy mô > 100 và ≤ 100 lợn thịt.
Ngoài ra, để nghiên cứu sự lưu hành kháng thể thụ động kháng PPV, chúng tôi tiến hành khảo sát ở 1 trang trại có tiêm vacxin PPV cho lợn nái. Các đối tượng lấy mẫu bao gồm: lợn nái (đẻ lứa 2), lợn con theo mẹ (tương ứng với mỗi lợn nái) và lợn sau cai sữa.
Do mẫu huyết thanh được thu thập từ 2 nhóm lợn khác nhau (nhóm tiêm vacxin (lợn nái) và nhóm không tiêm vacxin (lợn thịt), nênchúng tôi đã tách rời 2 nhóm này trong các phân tích về lưu hành huyết thanh học.
3.5.2. Phương pháp lấy mẫu máu lợn
Mẫu máu được lấy ở vịnh tĩnh mạch cổ của lợn (2- 3ml/cá thể), sau đó được để đông tự nhiên trong syringe. Chắt huyết thanh bằng cách ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong vòng 10 phút ở nhiệt độ phòng.Mẫu huyết thanh bảo quản ở - 20oC cho đến khi xét nghiệm.
3.5.3. Phương pháp chế hồng cầu chuột lang 0,5%
Lấy máu của chuột lang khỏe mạnh, cân nặng khoảng 200 gam. Hình 3.1 minh họa thao tác lấy máu vịnh tĩnh mạnh cổ chuột lang.
Cố định chuột lang nằm ngửa, cắt sạch lông vùng cửa vào lồng ngực, sát trùng vùng lấy máu bằng cồn 70%. Hút sẵn vào bơm tiêm một lượng dung dịch citrate natri 3% trước khi lấy máu. Máu lấy được cho vào ống ly tâm 15 ml đã chuẩn bị sẵn, lắc nhẹ. Rửa hồng cầu bằng cách ly tâm với tốc độ 1000 vòng/ phút trong 5 phút. Dùng pipette loại bỏ phần nước trong ở bên trên. Lặp lại bước rửa hồng cầu từ 3-4 lần để thu được hồng cầu sạch dùng cho phản ứng ngưng kết và ngăn trở ngưng kết hồng cầu. Pha dung dịch hồng cầu 0,5% bằng nước sinh lý.
3.5.4. Phương pháp thực hiện phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA) 3.5.4.1 Nguyên liệu 3.5.4.1 Nguyên liệu
- Hồng cầu chuột lang 0,5%;
- Kháng nguyên chuẩn Porcine Parvovirus (PPV); - Nước sinh lý 0,9%.
3.5.4.2. Tiến hành phản ứng
- Phản ứng được tiến hành trên đĩa nhựa 96 giếng đáy chữ V
- Dùng micropipette nhỏ đều vào tất cả các giếng, mỗi giếng 50 µl nước muối sinh lý 0,9%.
- Cho tiếp vào giếng đầu tiên của mỗi hàng 50 µl PPV, trộn đều sau đó hút 50 µl từ giếng thứ nhất sang giếng thứ hai, trộn đều và hút 50 µl từ giếng thứ 2 sang giếng thứ 3, cứ làm như vậy cho đến giếng cuối cùng. Đến giếng cuối cùng thì hút bỏ đi 50 µl.
- Như vậy trong mỗi giếng đều chứa một lượng 50 µl nhưng có độ pha loãng gấp đôi ở giếng tiếp theo. Ban đầu PPV có độ pha loãng là 1:2. Sau khi đã xử lý độ pha loãng của PPV ở các giếng là: 1/4, 1/8, ..., 1/4096.
- Dùng micropipette nhỏ đều vào mỗi giếng 50 µl dung dịch hồng cầu 0,5%, lắc nhẹ cho hồng cầu phân bố đều trong các giếng. Để ở nhiệt độ phòng trong vòng 0,5 giờ đọc kết quả.
- Bố trí đối chứng hồng cầu: nhỏ vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng 50 µl dung dịch nước muối sinh lý 0,9% và 50 µl dung dịch hồng cầu 0,5%.
3.5.4.3 Đọc kết quả phản ứng
- Phản ứng dương tính: hồng cầu bị ngưng kết thành mảng mỏng đều dưới đáy giếng, hoặc hồng cầu tản mạn xung quanh thành hình mạng lưới hay hình sao. Khi nghiêng đĩa không thấy hồng cầu chảy thành dòng.
- Phản ứng âm tính: không có hiện tượng ngưng kết hồng cầu, hồng cầu lắng xuống đáy thành cục tròn đỏ giống giếng đối chứng hồng cầu, khi nghiêng đĩa thấy hồng cầu chảy thành dòng.
- Hiệu giá phản ứng HA: là độ pha loãng virus cao nhất mà ở đó vẫn còn virus gây ngưng kết hồng cầu, người ta gọi đó là một đơn vị HA (HAU).
3.5.5. Phương pháp chuẩn độ ngược
Trong mỗi lần thực hiện phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu, lượng virus cần đảm bảo chính xác. Vì vậy, cần tiến hành chuẩn độ ngược để xác định chính xác việc pha 4 đơn vị HA là chính xác. Các bước thực hiện như sau:
- Trên đĩa nhựa 96 giếng đáy hình chữa V, dùng 4 dãy, mỗi dãy 4 giếng; - Nhỏ vào mỗi giếng 50 µl nước sinh lý;
- Ở giếng đầu của mỗi dãy, nhỏ 50 µl kháng nguyên đã pha 4 HAU;
- Trộn đều, hút đều 50 µl chuyển từ giếng thứ nhất sang giếng thứ hai, làm như vậy đến giếng thứ 3, thì hút bỏ đi 50 µl;
- Thể tích dung dịch trong mỗi giếng khi này là 50 µl. Hiệu giá HA của các giếng lần lượt là 2 HAU, 1 HAU và 1/2 HAU;
- Sau đó nhỏ 50 µl hồng cầu vào tất cả các giếng, giếng thứ 4 làm đối chứng chỉ có nước sinh lý và hồng cầu ;
- Để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút rồi đọc kết quả. Nếu ngưng kết hoàn toàn xảy ra đến giếng thứ hai, thì kháng nguyên pha đúng 4 HAU.
3.5.6. Phương pháp xử lý huyết thanh xét nghiệm
Để loại bỏ yếu tố gây ngưng kết, trước khi thực hiện phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu, toàn bộ mẫu huyết thanh trước xử lý bằng cách cho hấp phụ hồng cầu 10%. Các bước được tóm tắt như sau:
- Chuyển 0,1 ml huyết thanh xét nghiệm vào ống Eppendorf, chuyển 0,1 ml hồng cầu 10% (tỷ lệ 1:1), lắc nhẹ;
- Đậy nắp và để ngang ống cho diện tích tiếp xúc là lớn nhất; - Huyết thanh được giữ ở 4oC/12 giờ;
- Ly tâm 1000 vòng/ phút/5 phút, thu huyết thanh;
- Các mẫu huyết thanh sau khi đã được xử lý như trên không còn khả năng
3.5.7. Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI)
Phản ứng HI được dùng để xác định sự có mặt của kháng thể kháng PPV có trong huyết thanh của lợn.
3.5.7.1. Nguyên liệu
- Hồng cầu chuột lang 0,5%.
- Kháng nguyên Porcine Parvovirus (PPV): pha ở nồng độ 4 HAU. - Nước muối sinh lý 0,9%.
- Huyết thanh lợn cần xét nghiệm đã hấp phụ hồng cầu.
3.5.7.2. Tiến hành phản ứng
- Phản ứng được tiến hành trên đĩa 96 giếng đáy chữ V. - Pha loãng huyết thanh theo cơ số 2:
+) Dùng pipette cho đều vào mỗi giếng 25 µl nước muối sinh lý 0,9%. +) Mỗi mẫu huyết thanh lấy 25 µl cho vào giếng đầu tiên mỗi hàng. Sau đó dùng micropipet trộn đều và hút 25 µl từ giếng đầu tiên chuyển sang giếng thứ hai, trộn đều, hút 25 µl chuyển sang giếng thứ 3. Cứ làm như vậy đến giếng cuối cùng hút 25 µl dung dịch bỏ đi.
+) Dãy huyết thanh có độ pha loãng là: 1/4, 1/8, .... , 1/4096. - Thực hiện phản ứng trung hòa:
+) Dùng micropipette nhỏ đều vào mỗi giếng 25 µl dung dịch PPV đã pha thành 4 đơn vị HA, lắc nhẹ khay nhựa và đậy khay để ở nhiệt độ phòng 30 phút cho kháng nguyên và kháng thể tác động với nhau. Sau đó cho đều vào tất cả các giếng trên đĩa, mỗi giếng 50 µl dung dịch hồng cầu 0,5%.
- Đối chứng hồng cầu: cho vào mỗi giếng 50 µl dung dịch nước muối sinh lý 0,9% và 50 µl dung dịch hồng cầu 0,5%.
- Đối chứng virus: chuẩn độ ngược 4 đơn vị HA.
- Đối chứng ngưng kết không đặc hiệu của huyết thanh: cho vào mỗi giếng 25 µl dung dịch nước muối sinh lý 0,9%, 25 µl dung dịch huyết thanh và 50 µl dung dịch hồng cầu 0,5%. Nếu có hiện tượng ngưng kết hồng cầu, chứng tỏ có mặt của yếu tố ngưng kết không đặc hiệu.Mẫu huyết thanh khi này phải tiếp tục xử lý để loại bỏ yếu tố không đặc hiệu.
3.5.7.3. Đọc kết quả
- Sự hợp lệ của kết quả phản ứng: (i) đối chứng hồng cầu không có hiện tượng ngưng kết, (ii) hiện tượng ngưng kết chỉ đến giếng thứ 2, (iii) đối chứng huyết thanh & hồng cầu không có hiện tượng ngưng kết.
- Phản ứng dương tính: hồng cầu lắng thành cục tròn đỏ dưới đáy giếng giống đối chứng hồng cầu. Điều đó có nghĩa là trong huyết thanh có chứa kháng thể đặc hiệu kháng PPV, kháng thể đã kết hợp với virus tạo thành phức hợp kháng nguyên-kháng thể. Do đó virus đã kết hợp với kháng thể nên không còn khả năng gây ngưng kết hồng cầu, hồng cầu lắng thành cục tròn đỏ dưới đáy giếng. Hay nói cách khác kháng thể đã ngăn trở virus gây ngưng kết hồng cầu.
- Phản ứng âm tính: xảy ra hiện tương ngưng kết hồng cầu. Điều đó xảy ra khi trong huyết thanh không chứa kháng thể đặc hiệu với PPV, nên PPV không bị kết hợp để tạo phức hợp kháng nguyên-kháng thể. Kết quả là PPV tự do đã gây ngưng kết hồng cầu.
3.5.8. Phương pháp tách chiết ADN
Tinh sạch ADN tổng số được thực hiện theo các bước như sau:
(i) Ly giải mẫu
- 250 µl huyễn dịch mẫu bệnh phẩm được trộn đều trong 500 µl dung dịch sucrose/proteinase K;
- Ủ ở 56oC/90 phút hoặc 37oC/12giờ.
(ii) Tách pha ADN bằng phenol-chloroform-isoamyl (25:24:1)
- Bổ sung 200 µl dung dịch PCI vào ống mẫu sau khi ly giải; - Vortex hỗn hợp;
- Ly tâm 12.000 vòng/phút/15 phút, ở nhiệt độ 4oC.
(iii) Tủa ADN
- Dùng ống Eppendorf mới, trộn 450μl isopropyl + 450μl dịch nổi phía trên, trộn đều;
- Tủa ADN ở -20oC/15 phút;
- Ly tâm, 12.000 vòng/phút/15 phút, ở nhiệt độ 4oC.
(iv) Rửa tủa ADN
- Ly tâm, 12.000 vòng/phút/15 phút, ở nhiệt độ 4oC;
- Loại bỏ hết cồn. Hong khô ở nhiệt độ phòng trong 15 phút.
(v) Hòa tan tủa ADN
- Tủa ADN được hòa tan trong 30µl dung dịch đệm TE (pH = 8,0).
3.5.9. Phương pháp PCR phát hiện PPV
Cặp mồi đặc hiệu dùng phát hiện PPV được lựa chọn dựa theo nghiên cứu đã công bố (Xu, 2012), trình tự được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Trình tự mồi đặc hiệu phát hiện PPV Tên mồi xuôi/
ngược Trình tự 5’ – 3’ Vị trí gen NS1 Kích thước (bp) PPVF/ AGTTAGAATAGGATGCGAGGAA 1761–1782 265 /PPVR AGAGTCTGTTGGTGTATTTATTGG 2026–2002
Bảng 3.2 trình bày chu trình nhiệt của phản ứng PCR phát hiện PPV.
Bảng 3.2. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR Giai đoạn phản ứng Nhiệt độ (oC) Thời gian (giây) Số vòng lặp Tiền biến tính 94 180 1 Biến tính 94 15 40 Bắt mồi 57,1 20 Kéo dài 72 30
Kéo dài cuối cùng 72 300 1
Phân tích sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di trong thạch agarose 2%, có bổ sung RedSafeNucleic Acid Staining Solution 1x.
3.5.10. Phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại
Mối quan hệ di truyền của PPV (phylogenetic tree) được xây dựng dựa trên một phần trình tự gen mã hóa protein NS1. Phần mềm MEGA6 (Tamura, 2013) được dùng để xây dựng cây phát sinh chủng loại với các tham số đầu vào như sau: (i) phương pháp suy diễn cây phát sinh chủng loại là Neighbor- Joining; (ii) mô phỏng sự thay đổi nucleotide giữa các trình tự gen dựa vào mô hình Tajima-Nei và có hiệu chỉnh sự biến động giữa các nucleotide; (iii) mức tin cậy ở các nhánh của cây phát sinh chủng loại được ước tính bằng phép thử bootstrap lặp lại 1000 lần. Các trình tự tham chiếu (để xác định nhóm di truyền) dựa theo công bố trước đây.
Bảng 3.3. Trình tự gen NS1 dùng trong nghiên cứu
TT Mã số Tên chủng Nước TT Tên chủng Nước
1 NADL-2 NC001718 Mỹ 16 P1 Việt Nam
2 Kresse U44978 Mỹ 17 P2 Việt Nam
3 Tornau AY684869 Đức 18 P3 Việt Nam
4 IDT AY684872 Đức 19 P4 Việt Nam
5 POVG D00623 Tây Ban Nha 20 P5 Việt Nam 6 POVNADL-2 M38367 Mỹ 22 P6 Việt Nam 7 VRI-1 AY390557 Hàn Quốc 23 P7 Việt Nam 8 SR1 DQ675456 Trung Quốc 24 P8 Việt Nam 9 Unnamed AY502114 Trung Quốc 25 P9 Việt Nam 10 Nanjin-1 AY739664 Trung Quốc 26 P11 Việt Nam 11 HN-Z1 AY789533 Trung Quốc
12 HN-Z3 AY789534 Trung Quốc 13 NJ AY686601 Trung Quốc 14 NJ-2 AY789532 Trung Quốc 15 ZJ EU790642 Trung Quốc 16 BQ EU790641 Trung Quốc
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ CHUẨN HÓA PHẢN ỨNG NGĂN TRỞ NGƯNG KẾT HỒNG CẦU (HI) HỒNG CẦU (HI)
4.1.1. Tối ưu nồng độ hồng cầu
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng ngưng kết (HA)/ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) như: loại hồng cầu, nồng độ hồng cầu, thời gian ủ kháng nguyên- hồng cầu, nhiệt độ ủ đĩa, v.v... (Awad et al., 2012, Rasool et al., 2016). Trong nghiên cứu này, chúng tôi trước tiên tối ưu nồng độ hồng cầu dùng cho phản ứng.Phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA) được thực hiện với 3 nồng độ hồng cầu chuột lang là 0,5%, 0,6% và 1% để tìm ra nồng độphù hợp nhất. Kết quả được trình bày ở hình 4.1.
Hình 4.1. Kết quả xác định nồng độ hồng cầu tối ưu
Kháng nguyên PPV được pha loãng liên tiếp theo cơ số 2 từ 1/2 đến 1/1028. Đối chứng âm (-) không có virus, đối chứng dương (+) gồm virus và hồng cầu.
Ở cả 3 nồng độ hồng cầu đều có hiện tượng ngưng kết ở các độ pha loãng virus thấp (ví dụ từ 1/2 đến 1/32 ở giếng 1 đến giếng 5) và không ngưng kết ở các độ pha loãng virus cao (ví dụ 1/1028, giếng 10).
Ở cùng độ pha loãng virus, nồng độ hồng cầu khác nhau ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng ngưng kết. Ví dụ: hồng cầu 1% hiện tượng ngưng kết hoàn toàn xảy ra ở giếng thứ 5, hồng cầu 0,6% hiện tượng ngưng kết hoàn toàn đến giếng thứ 7, hồng cầu 0,5% hiện tượng ngưng kết hồng cầu hoàn toàn đến giếng thứ 8. Như vậy, nồng độ hồng cầu tối ưu nhất là 0,5%. Số
lượng hồng cầu trong dung dịch 0,5% được xác định là Xtb± SD = 203,86±
4.1.2. Tối ưu thời gian tương tác giữa huyết thanh- virus
Sau khi trộn đều huyễn dịch PPV chuẩn (pha ở 4 HAU) với huyết thanh dương chuẩn đã pha loãng (1/2 đến 1/512), chúng tôi để thời gian cho kháng thể trung hòa virus là 20 phút, 40 phút, 60 phút, 2 giờ, 4 giờ. Sau thời gian trên, tiến hành cho hồng cầu 0,5% vào các giếng, để 30 phút rồi đọc kết quả (hình 4.2).
Hình 4.2. Ảnh hưởng của thời gian tương tác virus- huyết thanh. Huyết thanh dương chuẩn được pha loãng liên tiếp theo cơ số 2 từ 1/2 đến 1/512
Trong các khoảng thời gian để kháng thể trung hòa virus ta thấy: sau thời gian tương tác 20 phút đến 4 giờ đều có thể quan sát được hiện tượng ngăn trở ngưng kết hồng cầu từ độ pha loãng 1/2 đến 1/8. Ở các độ pha loãng huyết thanh cao (1/16 đến 1/512) đều không còn hiện tượng ngăn trở ngưng kết hồng cầu. Hiệu giá kháng thể của mẫu huyết thanh dương chuẩn khi ủ với virus trong 5 khoảng thời gian kể trên đều cho giá trị 1/8. Nói cách khác, thời gian tương tác giữa huyết thanh- virus không có ảnh hưởng rõ rệt tới kết quả của phản ứng HI xác định hiệu giá kháng thể kháng PPV. Do đó, chỉ cần ủ huyết thanh cần chẩn đoán với virus trong vòng 20 phút. Việc xác định được thời gian phản ứng này có ý nghĩa trong công tác chẩn đoán, góp phần rút ngắn thời gian thực hiện phản ứng mà không làm ảnh hưởng tới kết quả thí nghiệm.
4.1.3. Loại trừ yếu tố ngưng kết trong huyết thanh xét nghiệm
Trong quá trình thực hiện phản ứng HI với mẫu huyết thanh lợn, chúng tôi nhận thấy khi ủ mẫu huyết thanh với hồng cầu, một số mẫu huyết thanh có hiện tượng ngưng kết với hồng cầu (hình 4.3).
Hình 4.3. Hiện tượng ngưng kết hồng cầu của huyết thanh xét nghiệm
Ở giếng đối chứng hồng cầu có hiện tượng hồng cầu lắng thành cục tròn