Phần 4 Kết quả và thảo luận
4.1. Kết quả chuẩn hóa phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI)
HỒNG CẦU (HI)
4.1.1. Tối ưu nồng độ hồng cầu
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng ngưng kết (HA)/ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) như: loại hồng cầu, nồng độ hồng cầu, thời gian ủ kháng nguyên- hồng cầu, nhiệt độ ủ đĩa, v.v... (Awad et al., 2012, Rasool et al., 2016). Trong nghiên cứu này, chúng tôi trước tiên tối ưu nồng độ hồng cầu dùng cho phản ứng.Phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA) được thực hiện với 3 nồng độ hồng cầu chuột lang là 0,5%, 0,6% và 1% để tìm ra nồng độphù hợp nhất. Kết quả được trình bày ở hình 4.1.
Hình 4.1. Kết quả xác định nồng độ hồng cầu tối ưu
Kháng nguyên PPV được pha loãng liên tiếp theo cơ số 2 từ 1/2 đến 1/1028. Đối chứng âm (-) không có virus, đối chứng dương (+) gồm virus và hồng cầu.
Ở cả 3 nồng độ hồng cầu đều có hiện tượng ngưng kết ở các độ pha loãng virus thấp (ví dụ từ 1/2 đến 1/32 ở giếng 1 đến giếng 5) và không ngưng kết ở các độ pha loãng virus cao (ví dụ 1/1028, giếng 10).
Ở cùng độ pha loãng virus, nồng độ hồng cầu khác nhau ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng ngưng kết. Ví dụ: hồng cầu 1% hiện tượng ngưng kết hoàn toàn xảy ra ở giếng thứ 5, hồng cầu 0,6% hiện tượng ngưng kết hoàn toàn đến giếng thứ 7, hồng cầu 0,5% hiện tượng ngưng kết hồng cầu hoàn toàn đến giếng thứ 8. Như vậy, nồng độ hồng cầu tối ưu nhất là 0,5%. Số
lượng hồng cầu trong dung dịch 0,5% được xác định là Xtb± SD = 203,86±
4.1.2. Tối ưu thời gian tương tác giữa huyết thanh- virus
Sau khi trộn đều huyễn dịch PPV chuẩn (pha ở 4 HAU) với huyết thanh dương chuẩn đã pha loãng (1/2 đến 1/512), chúng tôi để thời gian cho kháng thể trung hòa virus là 20 phút, 40 phút, 60 phút, 2 giờ, 4 giờ. Sau thời gian trên, tiến hành cho hồng cầu 0,5% vào các giếng, để 30 phút rồi đọc kết quả (hình 4.2).
Hình 4.2. Ảnh hưởng của thời gian tương tác virus- huyết thanh. Huyết thanh dương chuẩn được pha loãng liên tiếp theo cơ số 2 từ 1/2 đến 1/512 thanh dương chuẩn được pha loãng liên tiếp theo cơ số 2 từ 1/2 đến 1/512
Trong các khoảng thời gian để kháng thể trung hòa virus ta thấy: sau thời gian tương tác 20 phút đến 4 giờ đều có thể quan sát được hiện tượng ngăn trở ngưng kết hồng cầu từ độ pha loãng 1/2 đến 1/8. Ở các độ pha loãng huyết thanh cao (1/16 đến 1/512) đều không còn hiện tượng ngăn trở ngưng kết hồng cầu. Hiệu giá kháng thể của mẫu huyết thanh dương chuẩn khi ủ với virus trong 5 khoảng thời gian kể trên đều cho giá trị 1/8. Nói cách khác, thời gian tương tác giữa huyết thanh- virus không có ảnh hưởng rõ rệt tới kết quả của phản ứng HI xác định hiệu giá kháng thể kháng PPV. Do đó, chỉ cần ủ huyết thanh cần chẩn đoán với virus trong vòng 20 phút. Việc xác định được thời gian phản ứng này có ý nghĩa trong công tác chẩn đoán, góp phần rút ngắn thời gian thực hiện phản ứng mà không làm ảnh hưởng tới kết quả thí nghiệm.
4.1.3. Loại trừ yếu tố ngưng kết trong huyết thanh xét nghiệm
Trong quá trình thực hiện phản ứng HI với mẫu huyết thanh lợn, chúng tôi nhận thấy khi ủ mẫu huyết thanh với hồng cầu, một số mẫu huyết thanh có hiện tượng ngưng kết với hồng cầu (hình 4.3).
Hình 4.3. Hiện tượng ngưng kết hồng cầu của huyết thanh xét nghiệm
Ở giếng đối chứng hồng cầu có hiện tượng hồng cầu lắng thành cục tròn dưới đáy giếng, khi nghiêng đĩa thấy hồng cầu chảy thành dòng. Ngược lại, ở các giếng huyết thanh và hồng cầu, chúng tôi thấy có hiện tượng ngưng kết lấm tấm, với các mức độ khác nhau, khi nghiêng đĩa không thấy hiện tượng hồng cầu chảy thành dòng. Nói cách khác, trong huyết thanh có yếu tố gây ngưng kết hồng cầu. Hiện tượng ngưng kết này có thể do một số yếu tố gây ngưng kết không đặc hiệu và cũng có thể do sự hiện diện của virus gây ngưng kết hồng cầu (ví dụ PPV). Để khắc phục hiện tượng trên, chúng tôi cho huyết thanh hấp phụ hồng cầu 10% qua đêm ở 4oC. Kết quả xử lý được trình bày ở hình 4.4.
Hình 4.4. Kết quả loạibỏ hiện tượng ngưng kết hồng cầucủa huyết thanh
Mẫu huyết thanh sau khi hấp phụ với hồng cầu 10% được thử với dung dịch hồng cầu 1%. Hình 4.4 cho thấy ở mẫu thử (huyết thanh + hồng cầu) và đối chứng hồng cầu đều không có hiện tượng ngưng kết (hồng cầu lắng thành cục tròn dưới đáy đĩa, khi nghiêng đĩa có hiện tượng chảy thành dòng). Như vậy, hiện tượng ngưng kết có thể được xử lý bằng cách hấp phụ hồng cầu 10%. Từ kết quả này, chúng tôi đã xử lý toàn bộ mẫu huyết thanh lợn với hồng cầu 10% trước khi thực hiện phản ứng HI phát hiện kháng thể kháng PPV.
4.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨUSỰ LƯU HÀNH PPV BẰNG PHƯƠNG PHÁP HUYẾT THANH HỌC
Trong thực tế sản xuất, chỉ nhóm lợn đực giống và lợn nái mới được vacxin phòng bệnh do PPV gây ra. Thêm vào đó, kháng thể thụ động kháng PPV truyền qua sữa đầu được chứng minh tồn tại trong máu lợn con trong vòng 30 ngày (Stojanac et al., 2012). Cũng theo tác giả kể trên (Stojanac et
al., 2012), sự có mặt của kháng thể kháng PPV ở lợn sau 30 ngày tuổi là kết
quả của đáp ứng miễn dịch chủ động (lợn phơi nhiễm tự nhiên PPV và sản sinh kháng thể chống lại). Với các căn cứ trên, chúng tôi chọn lợn thịt để nghiên cứu sự lưu hành PPV.
4.2.1. Sự lưu hành kháng thể kháng PPV theo địa phương
Kết quả lấy mẫu và xét nghiệm kháng thể kháng PPV ở mỗi địa phương được trình bày ở các phần dưới đây.
Bảng 4.1. Kết quả thu thập mẫu huyết thanh tại các địa phương
TT Địa điểm Số trang trại Số mẫu huyết thanh
> 100 con ≤ 100 con > 100 con ≤ 100 con
1 Hà Nội 9 17 32 51 2 Hải Dương 4 10 20 37 3 Hưng Yên 1 7 6 24 4 Hòa Bình 5 16 25 77 5 Bắc Ninh 3 3 16 14 6 Vĩnh Phúc 2 11 8 30 Tổng hợp 24 64 107 233
Chúng tôi đã lấy mẫu ở 88 trang trại với tổng số 340 mẫu huyết thanh lợn thịt (giai đoạn 40 – 80 ngày tuổi) ở 6 tỉnh/ thành phố khu vực phía Bắc. Ở trang trại với quy mô > 100 và ≤ 100 lợn thịt, chúng tôi thu được lần lượt 108 và 233 mẫu. Hình 4.5 minh họa kết quả phản ứng HI phát hiện kháng thể kháng PPV.
Hình 4.5. Kết quả phản ứng HI phát hiện kháng thể kháng PPV
Hình 4.5 là ví dụ kết quả phản ứng HI với 8 mẫu huyết thanh (từ 1-8), mẫu được pha loãng liên tiếp theo cơ số 2 theo chiều từ trái sang phải. Vạch màu xanh đánh dấu sự chuyển tiếp từ ngăn trở ngưng kết hoàn toàn với không ngăn trở
ngưng kết. Có thể thấy rõ 8/8 mẫu đều có hiện tượng ngăn trở ngưng kết hồng cầu, tuy nhiên hiệu giá HI là khác nhau giữa các mẫu xét nghiệm. Tổng hợp kết quả xét nghiệm 340 mẫu được chúng tôi trình bày ở bảng 4.2.
Bảng 4.2. Kết quả xét nghiệm kháng thể kháng PPV
TT Địa điểm Số trang trại Số mẫu huyết thanh
Dương tính* Âm tính** Dương tính Âm tính
1 Hà Nội 25 1 54 29 2 Hải Dương 14 0 57 0 3 Hưng Yên 8 0 27 3 4 Hòa Bình 21 0 98 4 5 Bắc Ninh 6 0 28 2 6 Vĩnh Phúc 13 0 31 7 Tổng hợp 87 1 295 45
Ghi chú: * mẫu được đánh giá dương tính huyết thanh học nếu có hiệu giá HI ≥ 1/16, ** mẫu được đánh giá âm tính huyết thanh học nếu có hiệu giá HI ≤ 1/8.
Kết quả trình bày ở bảng 4.2 cho biết:
- Hầu hết các trang trại (87/88 trang trại) đều dương tính huyết thanh học với kháng thể kháng PPV,
- Tỷ lệ dương tính huyết thanh học trung bình là 86,76% (295/340 mẫu xét nghiệm dương tính với kháng thể kháng PPV),
- Tỷ lệ âm tính huyết thanh học trung bình là 13,24% (45/340 mẫu xét nghiệm âm tính với kháng thể kháng PPV).
Kết quả này cho thấy hầu hết lợn thịt ở các trang trại tiến hành nghiên cứu
đều phơi nhiễm với PPV. Bởi lẽ (i) lợn thịt không phải là đối tượng được tiêm
vacxin phòng bệnh do PPV gây ra, và (ii) kết quả nghiên cứu của Stojanac
(Stojanac et al., 2012) đã chỉ ra rằng kháng thể kháng PPV truyền qua sữa đầu
chỉ tồn tại trong máu của lợn con trong vòng 30 ngày. Tỷ lệ dương tính huyết thanh học rất cao ở nhóm lợn thịt gián tiếp cho thấy sự lưu hành phổ biến của PPV ở đàn lợn tại các địa phương tiến hành nghiên cứu.
Để làm rõ hơn đặc điểm về tỷ lệ dương tính huyết thanh học kháng thể kháng PPV ở lợn nuôi tại các địa phương lấy mẫu, chúng tôi tiến hành tổng hợp các mẫu huyết thanh dương tính theo mức hiệu giá HI (bảng 4.3).
Bảng 4.3. Tỷ lệ dương tính huyết thanh học theo hiệu giá HI
Địa điểm Tỷ lệ % ở hiệu giá HI (1/x) Tổng
hàng 16 32 64 128 256 512 1024 2048 Bắc Ninh 0,29 1,47 4,12 1,47 0,00 0,59 0,00 0,29 8,24 Vĩnh Phúc 0,29 1,76 0,88 2,65 2,06 0,59 0,00 0,88 9,12 Hưng Yên 0,59 0,88 1,76 2,35 0,00 0,29 0,59 1,47 7,94 Hòa Bình 0,00 3,82 8,53 9,12 2,94 1,18 0,59 2,65 28,82 Hà Nội 2,94 3,82 2,94 2,35 2,06 0,29 0,88 0,59 15,88 Hải Dương 0,29 2,06 2,94 3,53 2,06 0,88 2,65 2,35 16,76 Tổng cột 4,41 13,82 21,18 21,47 9,12 3,82 4,71 8,24 86,76
Theo phân loại về mức dương tính huyết thanh học (Tummaruk and Tantilertcharoen, 2012, Stojanac et al., 2012), mẫu huyết thanh có hiệu giá trong khoảng 1/16 ≤ HI ≤ 1/512 và HI > 1/512 lần lượt được xếp vào nhóm có hiệu giá kháng thể ở mức thấp và ở mức cao. Theo tiêu chí này, dễ dàng thấy rằng phần lớn (73,82%) các mẫu huyết thanh lợn thịt trong nghiên cứu này có hiệu giá kháng thể kháng PPV ở mức thấp, và chỉ có khoảng 13% số mẫu có hiệu giá kháng thể kháng PPV ở mức cao (vùng đánh dấu màu xám, bảng 4.3).
Xét ở khía cạnh dương tính huyết thanh học theo địa phương lấy mẫu, có thể thấy tỷ lệ dương tính là không đồng đều giữa các địa phương nghiên cứu: một số địa phương có tỷ lệ dương tính huyết thanh học trong khoảng 8- 9%, ngược lại, một số địa phương có tỷ lệ dương tính cao gấp 2 lần (~ 16%) hoặc gấp 3 lần (~ 29%). Kết quả kiểm định ANOVA cho biết sai khác về tỷ lệ dương tính huyết thanh học giữa Hà Nội và các tỉnh là đáng kể (p = 0,035 < 0,05).
4.2.2. Sự lưu hành kháng thể kháng PPV theo quy mô chăn nuôi
Nhằm xác định sự lưu hành kháng thể kháng PPV ở các đàn lợn có quy mô khác nhau, chúng tôi tổng hợp kết quả phản ứng HI theo 2 nhóm (quy mô ≤ 100 con và > 100 con) và được biểu diễn ở hình 4.6.
Hình 4.6. Kết quả HI phát hiện kháng thể kháng PPV
Bảng số liệu đính kèm biểu thị tỷ lệ % mẫu huyết thanh ở mỗi hiệu giá HI. Nhóm mẫu âm tính huyết thanh học được đánh dấu màu xám.
Kết quả cho thấy các đàn lợn nuôi có quy mô khác nhau đều có tỷ lệ âm tính huyết thanh học xung quanh 6% (6,47% và 6,76% tương ứng với đàn có quy mô ≤ 100 hoặc > 100 con). Kết quả phân tích phương sai (ANOVA một nhân tố) cho biết sự sai khác về tỷ lệ âm tính giữa 2 quy mô chăn nuôi là không có ý nghĩa thống kê (p = 0,957 >> 0,05). Ở nhóm lợn dương tính huyết thanh học, trong cả 2 quy mô chăn nuôi, các mẫu có hiệu giá kháng thể ở mức thấp (1/64 ≤ HI ≤ 1/128) chiếm tỷ lệ cao nhất (vùng giới hạn bởi đường nét đứt, hình 4.6). Kết quả kiểm định (hình 4.7) cho thấy tỷ lệ dương tính huyết thanh học giữa 2 quy mô chăn nuôi là khác biệt có ý nghĩa thống kê về (p = 0,031 < 0,05).
Hình 4.7. Kết quả kiểm định sự sai khác về tỷ lệ dương tính huyết thanh học giữa các quy mô chăn nuôi.
0 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024 2048 Quy mô ≤ 100 3.53 0.29 0.59 2.06 2.65 9.71 13.82 15.59 8.24 3.24 2.94 6.18 Quy mô > 100 4.71 0.00 0.29 1.76 1.76 4.12 7.35 5.88 1.18 0.59 1.76 2.06 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00
Quy mô ≤ 100 Quy mô > 100
% Hiệu giá kháng thể (1/x) +---+---+---+--- Quy mô ≤ 100 (---*---) Quy mô > 100 (---*---) +---+---+---+--- 0.0 3.0 6.0 9.0
Tỷ lệ dương tính trung bình của các đàn có quy mô ≤ 100 con () và của
đàn có quy mô > 100 con (). Khoảng tin cậy ở mức 95% được biểu thị bằng ký
hiệu (---).
Dễ nhận thấy tỷ lệ dương tính huyết thanh họctrung bình ở 2 quy mô chăn nuôi là khác nhau, với khoảng tin cậy 95% không nằm trong nhau(hình 4.7). Kết quả kiểm định cho biết tỷ lệ dương tính huyết thanh học của đàn có quy mô ≤ 100 con cao hơn so với đàn có quy mô > 100 con. Xét mối tương quan giữa dương tính huyết thanh học và quy mô đàn, kết quả này của chúng tôi là tương đồng với kết quả nghiên cứu sự lưu hành kháng thể kháng PPV ở đàn lợn nái nuôi tại Phần Lan (Oravainen et al., 2005). Ở nghiên cứu trên, những đàn nái có quy mô nhỏ thường có hiệu giá kháng thể kháng PPV cao hơn so với những đàn nái có quy mô lớn. Nhóm tác giả này giải thích:cơ sở chăn nuôi có quy mô lớn thường thiết kế chuồng theo các khối riêng biệt (compartment) nên đã hạn chế được sự phát tán của virus. Thêm vào đó, quy trình vacxin phòng bệnh nói chung và bệnh do PPV gây ra nói riêng ở các đàn có quy mô nhỏ được thực hiện không tốt như ở những đàn có quy mô chăn nuôi lớn (Oravainen et al., 2005).
4.2.3. Đặc điểm về nguồn gốc của kháng thể kháng PPV ở lợn thịt
Nghiên cứu của Stojanac và cộng sự (Stojanac et al., 2012) cho biết kháng
thể đặc hiệu kháng PPV tìm thấy trong máu của lợn sau 30 ngày tuổi là kết quả của đáp ứng miễn dịch chủ động. Nghiên cứu của chúng tôi đã phát hiện nhóm lợn thịt có tỷ lệ dương tính rất cao (86,76%) với kháng thể kháng PPV. Nhằm tìm hiểu về nguồn gốc của kháng thể kháng PPV ở lợn thịt, đề tài này bước đầu khảo sát sự lưu hành kháng thể ở 3 nhóm lợn: lợn nái (đã tiêm vacxin phòng bệnh do PPV), lợn con theo mẹ (7 ngày tuổi) và lợn con cai sữa (≥ 35 ngày tuổi). Những lợn con này được sinh ra từ những lợn nái khảo sát. Kết quả được trình bày ở hình 4.8.
Hình 4.8. So sánh tỷ lệdương tính huyết thanh học giữa các nhóm lợn
Phân tích 110 mẫu huyết thanh bằng phương pháp HI chokết quả 100% số mẫu xét nghiệm có kháng thể kháng PPV (ở các hiệu giá khác nhau), trong đó tỷ lệ dương tính ở nhóm lợn nái, lợn con theo mẹ và lợn sau cai sữa lần lượt là 36,36%, 31,82% và 31,82% (hình 4.8). Phân tích phương sai một nhân tố (ANOVA) cho thấy tỷ lệ dương tính giữa các nhóm lợn này không sai khác ở mức ý nghĩa α = 0,05 (p = 0,968 >> 0,05). Tuy nhiên, hiệu giá kháng thể giữa các nhóm có sự sai khác rõ rệt (p = 0,000 << 0,05). Đáng chú ý, hiệu giá kháng thể ở mức cao (HI = 1/512, vùng đóng khung ở hình 4.8) là vô cùng khác biệt giữa nhóm lợn nái & lợn con theo mẹ và nhóm lợn cai sữa. Cụ thể, tỷ lệ mẫu có hiệu giá HI = 1/512 ở nhóm lợn nái và lợn con theo mẹ trong khoảng 13,64% đến 18,18%, trong khi đó tỷ lệ này ở nhóm lợn sau cai sữa chỉ còn 1,82%. Thêm vào đó, chỉ phát hiện được mẫu huyết thanh có hiệu giá kháng thể thấp (HI =
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 64 128 256 512 % d ươ ng tí nh Lợn nái (n = 40) Theo mẹ (n = 35) Cai sữa (n = 35) % d ươ ng tí nh % d ươ ng tí nh 36,36% 31,82% 31,82%
1/64) chiếm tỷ lệ ~ 1% ở nhóm lợn sau cai sữa. Sự sai khác về hiệu giá HI kể trên