Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.7. Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI)
Phản ứng HI được dùng để xác định sự có mặt của kháng thể kháng PPV có trong huyết thanh của lợn.
3.5.7.1. Nguyên liệu
- Hồng cầu chuột lang 0,5%.
- Kháng nguyên Porcine Parvovirus (PPV): pha ở nồng độ 4 HAU. - Nước muối sinh lý 0,9%.
- Huyết thanh lợn cần xét nghiệm đã hấp phụ hồng cầu.
3.5.7.2. Tiến hành phản ứng
- Phản ứng được tiến hành trên đĩa 96 giếng đáy chữ V. - Pha loãng huyết thanh theo cơ số 2:
+) Dùng pipette cho đều vào mỗi giếng 25 µl nước muối sinh lý 0,9%. +) Mỗi mẫu huyết thanh lấy 25 µl cho vào giếng đầu tiên mỗi hàng. Sau đó dùng micropipet trộn đều và hút 25 µl từ giếng đầu tiên chuyển sang giếng thứ hai, trộn đều, hút 25 µl chuyển sang giếng thứ 3. Cứ làm như vậy đến giếng cuối cùng hút 25 µl dung dịch bỏ đi.
+) Dãy huyết thanh có độ pha loãng là: 1/4, 1/8, .... , 1/4096. - Thực hiện phản ứng trung hòa:
+) Dùng micropipette nhỏ đều vào mỗi giếng 25 µl dung dịch PPV đã pha thành 4 đơn vị HA, lắc nhẹ khay nhựa và đậy khay để ở nhiệt độ phòng 30 phút cho kháng nguyên và kháng thể tác động với nhau. Sau đó cho đều vào tất cả các giếng trên đĩa, mỗi giếng 50 µl dung dịch hồng cầu 0,5%.
- Đối chứng hồng cầu: cho vào mỗi giếng 50 µl dung dịch nước muối sinh lý 0,9% và 50 µl dung dịch hồng cầu 0,5%.
- Đối chứng virus: chuẩn độ ngược 4 đơn vị HA.
- Đối chứng ngưng kết không đặc hiệu của huyết thanh: cho vào mỗi giếng 25 µl dung dịch nước muối sinh lý 0,9%, 25 µl dung dịch huyết thanh và 50 µl dung dịch hồng cầu 0,5%. Nếu có hiện tượng ngưng kết hồng cầu, chứng tỏ có mặt của yếu tố ngưng kết không đặc hiệu.Mẫu huyết thanh khi này phải tiếp tục xử lý để loại bỏ yếu tố không đặc hiệu.
3.5.7.3. Đọc kết quả
- Sự hợp lệ của kết quả phản ứng: (i) đối chứng hồng cầu không có hiện tượng ngưng kết, (ii) hiện tượng ngưng kết chỉ đến giếng thứ 2, (iii) đối chứng huyết thanh & hồng cầu không có hiện tượng ngưng kết.
- Phản ứng dương tính: hồng cầu lắng thành cục tròn đỏ dưới đáy giếng giống đối chứng hồng cầu. Điều đó có nghĩa là trong huyết thanh có chứa kháng thể đặc hiệu kháng PPV, kháng thể đã kết hợp với virus tạo thành phức hợp kháng nguyên-kháng thể. Do đó virus đã kết hợp với kháng thể nên không còn khả năng gây ngưng kết hồng cầu, hồng cầu lắng thành cục tròn đỏ dưới đáy giếng. Hay nói cách khác kháng thể đã ngăn trở virus gây ngưng kết hồng cầu.
- Phản ứng âm tính: xảy ra hiện tương ngưng kết hồng cầu. Điều đó xảy ra khi trong huyết thanh không chứa kháng thể đặc hiệu với PPV, nên PPV không bị kết hợp để tạo phức hợp kháng nguyên-kháng thể. Kết quả là PPV tự do đã gây ngưng kết hồng cầu.