Phần 2 Tổng quan tài liệu
2.3. Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn
2.3.5. Tình hình đề kháng kháng sinh của Staphylococcus aureus và
Staphylococcus aureus kháng Methicillin trên thế giới và Việt Nam hiện nay 2.3.5.1. Tình hình đề kháng kháng sinh của Staphylococcus aureus và Staphylococcus aureus kháng Methicillin trên thế giới.
Năm 1941, Penicillin bắt đầu được đưa vào điều trị các bệnh nhiễm khuẩn do Staphylococci thì năm 1943 đã xuất hiện chủng S. aureus kháng penicillin.
Ngay từ năm 1946 ở London, Barber và Garrod phân lập được 14% các
Staphylococcus aureus đề kháng với Penicillin do tiết ra men penicillinase tiêu hủy kháng sinh. Tỷ lệ này dã tăng lên nhanh chóng từ 38% năm 1947 đến 59% năm 1948. Tại Mỹ, sự đề kháng này hiếm thấy trước năm 1980, hiện nay đã phát triển với tỷ lệ đáng báo động (Eugénie and Pierre, 2004).
Tại Pháp từ năm 1948 hiện tượng này được Chabbert ghi nhận đến năm 1962 là 17%, năm 1965 là 35%, năm 1975 là 44%.
Ngày nay có đến 90% S. aureus kháng Penicillin và đang có xu hướng gia tăng chủng S. aureus kháng Methicillin.
Năm 1961 tại Anh MRSA được phát hiện, các trường hợp đầu tiên được báo cáo của MRSA đã xuất hiện vào giữa những năm 1990 ở Úc, Hoa Kỳ, Anh, Pháp,… Tại Anh đến năm 1993 có 51 ca tử vong liên quan đến MRSA, năm 2005 có 1629 ca tử vong, năm 2006 có 1652 ca tử vong liên quan đến MRSA chiếm 50%.
Từ đầu những năm 1980, Vancomycin đã được đưa vào điều trị các nhiễm khuẩn do MRSA, đặc biệt là những ca nhiễm khuẩn bệnh viện. Tuy nhiên chủng
S. aureus giảm nhạy cảm với Vancomycin đã được tìm thấy ở Nhật Bản đầu tiên vào năm 1997, sau đó ở một số nước khác như Úc, Đức,… gần đây 2 chủng
S. aureus đề kháng hoàn toàn với Vancomycin đã được tìm thấy tại Mỹ năm 2002. Trong một nghiên cứu về Vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng Methicillin ở lợn và người chăn nuôi lợn nhằm đánh giá tỷ lệ nhiễm khuẩn MRSA ở lợn và người chăn nuôi lợn ở Ontario, Canada năm 2007, trong 285 mẫu gạc mũi và trực tràng thu thập được ở 285 con lợn từ 3 nhóm tuổi khác nhau từ 20 trang trại lợn thì tỉ lệ nhiễm khuẩn MRSA tại các trang trại là 45% (9/20) trong khi tỷ lệ lưu hành tại lợn là 24,9% (71/285). Không có sự khác biệt trong việc nhiễm MRSA ở các nhóm tuổi (Khanna et al., 2008).
2.3.5.2. Tình hình đề kháng kháng sinh của Staphylococcus aureus và Staphylococcus aureus kháng Methicillin tại Việt Nam
Trong báo cáo “Hội nghị tổng kết công tác hội đồng thuốc và điều trị, hoạt động theo dõi sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh thường gặp năm 2005” nghiên cứu tại 5 bệnh viện cho kết quả S. aureus (10,7%), Acinetobacter spp
(10,3%), E. coli (10,7%).
aureus phân lập từ bệnh phẩm cho thấy có đến 94,1% chủng kháng Penicillin, 52,9% kháng Ciproflorxacin, 52% kháng Amoxcillin và 12,5% kháng Gentamycin (Nguyễn Thị Kê và cs., 2006).
Báo cáo “khảo sát tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện tại bệnh viện Thống Nhất từ 15/10/2004 - 30/6/2005” (Vũ Thị Kim Cương, 2007) cho thấy Staphylocuccus spp kháng trên 65% với hầu hết các kháng sinh, thậm chí đến 97,7% với Penicillin.
Theo kết quả khảo sát tỉ lệ kháng kháng sinh và gen quy định độc tố exfoliative toxins của các chủng Staphylococus aureus phân lâp tại viện Pasteur TP.HCM năm 2015 các chủng S. aureus nghiên cứu được phân lập từ tháng 12 năm 2012 đến tháng 2 năm 2015 từ các mẫu bệnh phẩm: đờm, mủ, máu, nước tiểu, phân, dịch âm đạo, dịch niệu đạo tại khoa sinh học lâm sang - Viện Pasteur TP.HCM thì trong tổng số 293 chủng S. aureus được kiểm tra có 145/293 chủng
S. aureus kháng Methicillin chiếm 49,7% và 147/293 chủng S. aureus nhạy cảm Methicillin chiếm 50,05%. S. aureus kháng với gần như tất cả các loại kháng sinh được khảo sát. Kháng sinh có tỉ lệ thấp nhất là Pristinamycin (2,4%) và cao nhất là Penicillin (86%). Tỷ lệ kháng Oxacilline tăng cao 49,7%. Tất cả các chủng còn nhạy cảm với kháng sinh Vancomycin (Ám et al., 2012).
Báo cáo “tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn Staphylococcus aureus” kết quả nghiên cứu trên 235 chủng vi khuẩn của Phạm Hùng Vân năm 2005. Các chủng S. aureus từ 7 bệnh viện ở Đà Nẵng, Cần Thơ và thành phố Hồ Chí Minh cho thấy S. aureus tỷ lệ kháng Methicillin 47%, Gentamycin 42%, Erythromycin 63%, Azithromycin 68%, Ciprofloxacin 39%, Cefuroxime 38%, Amoxicillin- clavulanic 30%, Cefepime 34%, Ticarcillin clavulanic acid 28%, Chloramphenicol 38%, Cotrimoxazol 25%, Levofloxacine 17% và chỉ 8% đối với Pifampicine. Nghiên cứu cho thấy vi khuẩn S. aureus kháng Methicillin có tỷ lệ đề kháng các kháng sinh cao hơn rất rỗ rệt so với vi khuẩn nhạy cảm Methicillin.
Trong báo cáo sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh thường gặp tại bệnh viện Thống Nhất trong năm 2006 của Cao Minh Nga đã phân lập được 1884 chủng vi khuẩn từ các bệnh phẩm. Trong đó S. aureus kháng kháng sinh chiếm 7,27%, xuất hiện chủng S. aureus kháng ở mức trung gian với Vancomycin chiểm 0,76%.
của vi khuẩn gây bệnh thường gặp tại bệnh viện nhi đồng tháng 2 năm 2007 đã phân lập được 2738 chủng vi khuẩn từ các mẫu bệnh phẩm. Trong đó có 311 chủng S. aureus kháng Methicillin chiếm 33,5%.
Theo Vũ Ngọc Hiếu, Phạm Hồng Nhung trong nghiên cứu mức độ kháng kháng sinh của một số vi khuẩn thường gặp gây nhiễm trùng da và mô mềm ở bệnh nhân đái tháo đường phân lập tại bệnh viện Bạch Mai, trên 487 bệnh nhân đái tháo đường có bệnh phẩm nhiễm trùng da và mô mềm dương tính với vi khuẩn từ ngày 1/1/2013 - 31/1/2017 tại khoa vi sinh, bệnh viện Bạch Mai tác nhân hàng đầu phân lập được là Staphylococcus aureus chiếm 32.4%. Tỷ lệ
Staphylococcus aureus kháng Methicillin là 53,7%.
Trong báo cáo “Chọn lựa kháng sinh ban đầu trong điều trị nhiễm khuẩn tại một số bệnh viện ở thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 8/2009 đến tháng 8/2010” của GS.TS. Nguyễn Thanh Bảo và PGS.TS. Cao Minh Nga năm 2011, cho thấy có 6 loại vi khuẩn thường gặp nhất trong các loại nhiễm khuẩn bệnh viện. Trong đó S. aureus chiếm 7,66%.
2.3.6. Phƣơng pháp xác định độ mẫn cảm của vi khuẩn gây bệnh đối với một số thuốc kháng sinh
Thực tế không chỉ ở Việt Nam mà tại nhiều nước việc sử dụng kháng sinh không theo chỉ dẫn đã dẫn đến tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn ngày càng phát triển, gây khó khăn cho công tác điều trị lâm sàng trong nhân y cũng như trong thú y. Trong lâm sàng để lựa chọn thuốc điều trị thích hợp ngày càng khó khăn. Một trong những hướng lựa chọn thuốc là xét nghiệm xác định độ mẫn cẩm của vi khuẩn gây bệnh với một số thuốc kháng sinh hay còn gọi là kỹ thuật kháng sinh đồ.
Kháng sinh đồ là kỹ thuật tìm hiểu và đánh giá mức độ mẫn cảm của vi khuẩn với các loại kháng sinh, qua đó định hướng cho thầy thuốc sử dụng kháng sinh một cách khoa học, nhằm nâng cao hiệu quả điều trị, hạn chế hiện tượng nhờn thuốc, kháng thuốc của vi khuẩn.
Có nhiều cách để đánh giá độ mẫn cảm của vi khuẩn với thuốc kháng sinh như phương pháp đặt ống trụ, khuếch tán trên thạch,… Trong đó, phổ biến nhất là kỹ thuật khoanh giấy khuếch tán dựa trên nguyên lý của Kirby-Bauer (Nguyễn Xuân Thành và cs.,2005). Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán có thể áp dụng cho tất cả các phòng thí nghiệm vi sinh, trong các bệnh viện và cho các
trung tâm y tế. Ưu điểm của kỹ thuật này là có thể cùng một lúc thử tác dụng của nhiều loại kháng sinh trên cùng một loại vi khuẩn. Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý kháng sinh ở trong khoanh giấy sẽ khuếch tán vào thạch Mueler-Hinton có chứa các chủng vi khuẩn thử nghiệm. Mức độ khuếch tán phụ thuộc vào phân tử lượng của từng loại kháng sinh và vào độ dày của thạch trên đĩa petri. Do đó, nồng độ kháng sinh càng gần khoanh giấy thì càng cao, càng xa khoanh giấy thì càng thấp. Và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh được biểu hiện bằng đường kính các vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh. Những vùng xung quanh khoanh giấy là vùng ức chế. Đường kính của vòng vô khuẩn càng lớn thì chứng tỏ khả năng mẫn cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh đó càng cao, vi khuẩn đó nhạy cảm với kháng sinh. Ngược lại, nếu đường kính nhỏ hay vi khuẩn mọc sát vào mép kháng sinh chứng tỏ vi khuẩn đó không nhạy cảm (kháng) với kháng sinh trong tẩm giấy.
PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 8/2018 đến tháng 6/2019.
3.2. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Mẫu thí nghiệm được thu thập tại một số huyện thuộc tỉnh Bắc Ninh Thí nghiệm được thực hiện tại bộ môn Vệ sinh thú y, Viện thú y.
3.3. NGUYÊN VẬT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU
3.3.1. Đối tƣợng, vật liệu
Các chủng Staphylococcus aureus và Staphylococcus aureus kháng Methicillin phân lập được từ mẫu tăm bông ngoáy mũi lợn.
3.3.2. Môi trƣờng và hoá chất
a. Phân lập Staphylococcus aureus
- Môi trường tăng sinh Pepton Buffered Water (PBW) (Merck, Đức) - Baird Parker agar (Merck, Đức)
- Thạch máu cừu 5% (Merck, Đức) - Nutrient broth (Merck, Đức) - Nutrient agar (Merck, Đức)
- Bộ thuốc nhuộm Gram (Merck, Đức) - Huyết tương thỏ đông khô (Merck, Đức) - H2O2 3% (Merck, Đức)
- Manitol salt phenol agar (Merck, Đức) - BHI broth (Merck, Đức)
- Môi trường giữ giống vi khuẩn BHI glycerol 10%
b. Phân lập MRSA
- Môi trường tăng sinh Pepton Buffered Water (PBW) (Merck, Đức) - CHROMagar MRSA (CHROMagar, Pháp)
- Nutrient agar (Merck, Đức)
- Môi trường giữ giống vi khuẩn BHI glycerol 10%
Bảng 3.1. Trình tự các đoạn mồi đƣợc sử dụng trong Multiplex - PCR
Mồi
(Primer) Gene Trình tự oligonucleotide (5′-3′)
Kích cỡ DNA đƣợc khuếch đại (bp) Tài liệu tham khảo
mecA P4 mecA TCCAGATTACAACTTCACCAGG 162 (1)
mecA P7 CCACTTCATATCTTGTAACG
spa‐1113f Spa TAAAGACGATCCTTCGGTGAGC (180- 600) (2) spa‐1514r CAGCAGTAGTGCCGTTTGCTT pvl‐FP lukF- PV GCTGGACAAAACTTCTTGGAATAT 83 (3) pvl‐RP GATAGGACACCAATAAATTCTG GATTG mecALGA2 51FP mecA LGA251 TCACCAGGTTCAAC[Y]CAAAA 356 (4) mecALGA2 51RP CCTGAATC[W]GCTAATAATATTTC
Ghi chú : (1): (Duarte C Oliveira and Hermínia De Lencastre, 2002) (2): (Dag Harmsen, Heike Claus et al., 2003)
(3): (Ruud H Deurenberg, Cornelis Vink et al., 2004) (4): (Christiane Cuny, Franziska Layer et al., 2011) - Dream taq green PCR mastermix
- DNA của vi khuẩn trong nước free-nuclease - 100bp plus DNA marker
c. Môi trường, hoá chất làm kháng sinh đồ
- Thạch Mueller - Hinton
- Khoanh giấy tẩm kháng sinh (10 loại) - Nước muối sinh lí 0,85%
- Ống so màu độ đục chuẩn (McFarland 0,5) - Chủng chuẩn quốc tế (ATCC)
3.3.3. Trang thiết bị, dụng cụ phòng thí nghiệm
Nồi hấp, tủ ấm, tủ sấy, máy Stomacher, máy li tâm, buồng cấy, máy đo pH, máy trộn Voltex, …
Bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri, cốc đong, ống đong, phễu, pipet, đèn cồn, que cấy, túi đựng mẫu, thước đo vòng vô khuẩn…
Tất cả các dụng cụ, hoá chất, môi trường nuôi cấy, môi trường phân lập và giám định vi khuẩn đều phải vô trùng tuyệt đối trước khi sử dụng.
3.4. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.4.1. Nội dung
a. Điều tra cơ bản về tình hình sử dụng kháng sinh cho lợn tại một số huyện của tỉnh Bắc Ninh.
b. Phân lập và xác định đặc tính sinh hoá của các chủng S. aureus và MRSA phân lập được.
c. Xác định mức độ mẫn cảm kháng sinh của các chủng S. aureus và MRSA phân lập được đối với 10 loại kháng sinh cần kiểm soát mức độ kháng thuốc theo tiêu chuẩn Quốc tế.
3.4.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.4.2.1. Khảo sát hiện trạng sử dụng thuốc kháng sinh cho lợn
Chúng tôi thực hiện điều tra/ theo dõi thu thập thông tin tại 110 hộ chăn nuôi lợn tại một số huyện thuộc tỉnh Bắc Ninh theo sổ ghi chép nhật ký sử dụng kháng sinh tại hộ chăn nuôi lợn. Sổ được phát cho mỗi hộ điều tra và hướng dẫn người chăn nuôi cách ghi chép lại nhật kí sử dụng thuốc, đồng thời đào tạo cán bộ thú y địa phương để nhắc nhở, đôn đốc người chăn nuôi việc ghi chép và lưu giữ vỏ lọ/ nhãn thuốc đã sử dụng.
Các thông tin trong sổ ghi chép bao gồm: thông tin hộ chăn nuôi, tổng đàn, số lượng lợn ốm, lợn chết theo từng giai đoạn, tên thuốc kháng sinh sử dụng, liều dùng, thời gian dùng,… (theo mẫu phụ lục 1).
Định kì một tuần một lần chúng tôi quay trở lại kiểm tra cách ghi chép của người chăn nuôi. Trong quá trình đó, nếu có hộ nào quên hoặc ghi chép chưa chính xác sẽ được điều chỉnh kịp thời.
Quá trình theo dõi sử dụng kháng sinh cho đàn lợn nuôi trong thời gian 4 tháng từ tháng 9 năm 2018 đến tháng 12 năm 2018. Thông tin ghi chép trong sổ
nhật kí sử dụng kháng sinh và các vỏ lọ/ nhãn thuốc đã sử dụng được chủ hộ và cán bộ thú y địa phương thu thập và gửi lại. Kết quả này được kiểm tra chéo và hoàn thiện hơn qua thông tin vỏ lọ/ nhãn thuốc đã sử dụng. Bộ dữ liệu này được tổng hợp và phân tích bằng phần mềm excel.
3.4.2.2. Phương pháp lấy mẫu
Mẫu tăm bông ngoáy mũi lợn được lấy tại các hộ chăn nuôi lợn trên địa bàn tỉnh Bắc Ninh.
Lấy mẫu theo QCVN 01 - 83: 2011/BNNPTNT cụ thể:
-Bước 1: Dùng dụng cụ chuyên dụng cố định để hở mũi, giữ lợn ở vị trí hướng lên, hạn chế chuyển động của lợn.
-Bước 2: Lau sạch mõm lợn và đưa tăm bông vô trùng vào trong khoang mũi, tránh tiếp xúc với bên ngoài lỗ mũi.
Xoay nhẹ nhàng tăm bông trong lỗ mũi, tránh làm tổn thương xoang mũi của lợn.
Lặp lại với lỗ mũi còn lại, dùng cùng 1 tăm bông.
- Bước 3: Đưa tăm bông thu được vào trong ống vô trùng chứa dung dịch bảo quản mẫu
- Bước 4: Đánh dấu ký hiệu mẫu trên thân ống (ký hiệu mẫu, đặc điểm nhận dạng, tuổi lợn, ngày lấy mẫu).
3.4.2.3.Phân lập Staphylococcus aureus theo quy trình ISO 6888-1:1999 (Sơ đồ 3.1)
- Tăng sinh không chọn lọc: tăm bông ngoáy mũi lợn được nuôi cấy tăng sinh trong 5ml BPW qua đêm
- Cấy chuyển mẫu
Lấy 1 vòng que cấy vô trùng 10µl dung dịch mẫu đã tăng sinh ria cấy trên môi trường thạch Baird Parker. Lật ngược các đĩa thạch và nuôi trong tủ ấm 35 - 370C/ 24 - 48h ± 2h.
- Đọc kết quả
Sau 24h ± 2h trên môi trường thạch Baird - Paker khuẩn lạc điển hình có đường kính 1,0 - 1,5 mm, màu đen hoặc xám, sáng và lồi, có quầng sáng hẹp bao quanh khuẩn lạc. Những khuẩn lạc điển hình được đánh dấu và tiếp tục ủ trong 24h nữa.
Sau 48±4h, khuẩn lạc S. aureus có đường kính 1.5 - 2,0 mm, khuẩn lạc thường được bao quanh bởi một quầng sáng rộng.
Khuẩn lạc không điển hình là những khuẩn lạc có kích thước khác so với khuẩn lạc điển hình và không có quầng sáng.
Sơ đồ 3.1. Quy trình phân lập Staphylococcus aureus theo ISO 6888-1:1999
Tăm bông ngoáy mũi lợn trong 5ml BPW
1 vòng que cấy 10µl dịch mẫu đã tăng sinh
Baird Parker agar
5 khuẩn lạc điển hình (tròn, nhẵn, lồi, ướt, màu đen xám/đen nhánh, có quầng sáng đục bao quanh
Khẳng định
Kiểm tra hình thái
VK
Coagulaze Catalaze Mannitol Thử dung huyết Nhuộm Gram Brain Heart Infusion 300µl huyết tương thỏ H2O2 3% Thạch Mannitol Thạch máu cừu
SA identification: Gram (+), Coagulaza (+), Catalaza (+), Dung huyết (+) 35-37 ° C/24h 35-37 ° C/4-6h 35-37 ° C/24h 35-37°C/24h 35-37 ° C/16-18h
- Các test kiểm tra khẳng định vi khuẩn S. aureus:
Chọn khuẩn lạc điển hình tiến hành làm các phản ứng khẳng định
+) Nhuộm gram và soi trên kính hiển vi: vi khuẩn S. aureus là những tụ cầu khuẩn đứng thành đám, hình chùm nho, bắt màu Gram (+).
+) Phản ứng Catalase: vi khuẩn S. aureus có men catalase gây xúc tác cho phản ứng thuỷ phân hydrogen peroxide (H2O2) thành H2O và O2, gây hiện tượng sủi bọt khi kiểm tra.
+) Phản ứng Coagulase: vi khuẩn S. aureus có men coagulase có tác dụng làm ngưng kết các thành phần của huyết tương thỏ tạo thành các khối huyết tương đông vón.
3.4.2.3. Phân lập vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng Methicillin bằng kỹ thuật Multiplex PCR
- Tăng sinh không chọn lọc: tăm bông ngoáy mũi lợn được nuôi cấy tăng sinh trong 5ml PBW qua đêm.