Nồi hấp, tủ ấm, tủ sấy, máy Stomacher, máy li tâm, buồng cấy, máy đo pH, máy trộn Voltex, …
Bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri, cốc đong, ống đong, phễu, pipet, đèn cồn, que cấy, túi đựng mẫu, thước đo vòng vô khuẩn…
Tất cả các dụng cụ, hoá chất, môi trường nuôi cấy, môi trường phân lập và giám định vi khuẩn đều phải vô trùng tuyệt đối trước khi sử dụng.
3.4. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.4.1. Nội dung
a. Điều tra cơ bản về tình hình sử dụng kháng sinh cho lợn tại một số huyện của tỉnh Bắc Ninh.
b. Phân lập và xác định đặc tính sinh hoá của các chủng S. aureus và MRSA phân lập được.
c. Xác định mức độ mẫn cảm kháng sinh của các chủng S. aureus và MRSA phân lập được đối với 10 loại kháng sinh cần kiểm soát mức độ kháng thuốc theo tiêu chuẩn Quốc tế.
3.4.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.4.2.1. Khảo sát hiện trạng sử dụng thuốc kháng sinh cho lợn
Chúng tôi thực hiện điều tra/ theo dõi thu thập thông tin tại 110 hộ chăn nuôi lợn tại một số huyện thuộc tỉnh Bắc Ninh theo sổ ghi chép nhật ký sử dụng kháng sinh tại hộ chăn nuôi lợn. Sổ được phát cho mỗi hộ điều tra và hướng dẫn người chăn nuôi cách ghi chép lại nhật kí sử dụng thuốc, đồng thời đào tạo cán bộ thú y địa phương để nhắc nhở, đôn đốc người chăn nuôi việc ghi chép và lưu giữ vỏ lọ/ nhãn thuốc đã sử dụng.
Các thông tin trong sổ ghi chép bao gồm: thông tin hộ chăn nuôi, tổng đàn, số lượng lợn ốm, lợn chết theo từng giai đoạn, tên thuốc kháng sinh sử dụng, liều dùng, thời gian dùng,… (theo mẫu phụ lục 1).
Định kì một tuần một lần chúng tôi quay trở lại kiểm tra cách ghi chép của người chăn nuôi. Trong quá trình đó, nếu có hộ nào quên hoặc ghi chép chưa chính xác sẽ được điều chỉnh kịp thời.
Quá trình theo dõi sử dụng kháng sinh cho đàn lợn nuôi trong thời gian 4 tháng từ tháng 9 năm 2018 đến tháng 12 năm 2018. Thông tin ghi chép trong sổ
nhật kí sử dụng kháng sinh và các vỏ lọ/ nhãn thuốc đã sử dụng được chủ hộ và cán bộ thú y địa phương thu thập và gửi lại. Kết quả này được kiểm tra chéo và hoàn thiện hơn qua thông tin vỏ lọ/ nhãn thuốc đã sử dụng. Bộ dữ liệu này được tổng hợp và phân tích bằng phần mềm excel.
3.4.2.2. Phương pháp lấy mẫu
Mẫu tăm bông ngoáy mũi lợn được lấy tại các hộ chăn nuôi lợn trên địa bàn tỉnh Bắc Ninh.
Lấy mẫu theo QCVN 01 - 83: 2011/BNNPTNT cụ thể:
-Bước 1: Dùng dụng cụ chuyên dụng cố định để hở mũi, giữ lợn ở vị trí hướng lên, hạn chế chuyển động của lợn.
-Bước 2: Lau sạch mõm lợn và đưa tăm bông vô trùng vào trong khoang mũi, tránh tiếp xúc với bên ngoài lỗ mũi.
Xoay nhẹ nhàng tăm bông trong lỗ mũi, tránh làm tổn thương xoang mũi của lợn.
Lặp lại với lỗ mũi còn lại, dùng cùng 1 tăm bông.
- Bước 3: Đưa tăm bông thu được vào trong ống vô trùng chứa dung dịch bảo quản mẫu
- Bước 4: Đánh dấu ký hiệu mẫu trên thân ống (ký hiệu mẫu, đặc điểm nhận dạng, tuổi lợn, ngày lấy mẫu).
3.4.2.3.Phân lập Staphylococcus aureus theo quy trình ISO 6888-1:1999 (Sơ đồ 3.1)
- Tăng sinh không chọn lọc: tăm bông ngoáy mũi lợn được nuôi cấy tăng sinh trong 5ml BPW qua đêm
- Cấy chuyển mẫu
Lấy 1 vòng que cấy vô trùng 10µl dung dịch mẫu đã tăng sinh ria cấy trên môi trường thạch Baird Parker. Lật ngược các đĩa thạch và nuôi trong tủ ấm 35 - 370C/ 24 - 48h ± 2h.
- Đọc kết quả
Sau 24h ± 2h trên môi trường thạch Baird - Paker khuẩn lạc điển hình có đường kính 1,0 - 1,5 mm, màu đen hoặc xám, sáng và lồi, có quầng sáng hẹp bao quanh khuẩn lạc. Những khuẩn lạc điển hình được đánh dấu và tiếp tục ủ trong 24h nữa.
Sau 48±4h, khuẩn lạc S. aureus có đường kính 1.5 - 2,0 mm, khuẩn lạc thường được bao quanh bởi một quầng sáng rộng.
Khuẩn lạc không điển hình là những khuẩn lạc có kích thước khác so với khuẩn lạc điển hình và không có quầng sáng.
Sơ đồ 3.1. Quy trình phân lập Staphylococcus aureus theo ISO 6888-1:1999
Tăm bông ngoáy mũi lợn trong 5ml BPW
1 vòng que cấy 10µl dịch mẫu đã tăng sinh
Baird Parker agar
5 khuẩn lạc điển hình (tròn, nhẵn, lồi, ướt, màu đen xám/đen nhánh, có quầng sáng đục bao quanh
Khẳng định
Kiểm tra hình thái
VK
Coagulaze Catalaze Mannitol Thử dung huyết Nhuộm Gram Brain Heart Infusion 300µl huyết tương thỏ H2O2 3% Thạch Mannitol Thạch máu cừu
SA identification: Gram (+), Coagulaza (+), Catalaza (+), Dung huyết (+) 35-37 ° C/24h 35-37 ° C/4-6h 35-37 ° C/24h 35-37°C/24h 35-37 ° C/16-18h
- Các test kiểm tra khẳng định vi khuẩn S. aureus:
Chọn khuẩn lạc điển hình tiến hành làm các phản ứng khẳng định
+) Nhuộm gram và soi trên kính hiển vi: vi khuẩn S. aureus là những tụ cầu khuẩn đứng thành đám, hình chùm nho, bắt màu Gram (+).
+) Phản ứng Catalase: vi khuẩn S. aureus có men catalase gây xúc tác cho phản ứng thuỷ phân hydrogen peroxide (H2O2) thành H2O và O2, gây hiện tượng sủi bọt khi kiểm tra.
+) Phản ứng Coagulase: vi khuẩn S. aureus có men coagulase có tác dụng làm ngưng kết các thành phần của huyết tương thỏ tạo thành các khối huyết tương đông vón.
3.4.2.3. Phân lập vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng Methicillin bằng kỹ thuật Multiplex PCR
- Tăng sinh không chọn lọc: tăm bông ngoáy mũi lợn được nuôi cấy tăng sinh trong 5ml PBW qua đêm.
- Cấy chuyển mẫu: lấy một vòng que cấy vô trùng 10µl dung dịch mẫu đã tăng sinh ria cấy trên môi trường thạch Chromagar MRSA đã được chuẩn bị để ở 35-370C trong 24h
- Đọc kết quả:
Sau 24h nuôi cấy, khuẩn lạc MRSA điển hình có màu hồng hoặc tím hoa cà Chọn ra 5 khuẩn lạc điển hình tiếp tục làm khẳng định bằng phương pháp Multiplex PCR.
- Multiplex PCR MRSA : Các thành phần của phản ứng
0,4µM của mỗi mồi được thêm vào bộ Dream taq green PCR master mix trước khi thêm DNA của vi khuẩn. Phản ứng khếch đại được thực hiện với chương trình sau:
+) 15 phút ở 940C
+) Sau đó là 30 chu kì 30 giây tại 940C, 1 phút ở 590C và 1 phút ở 720
C +) Cuối cùng kéo dài 10 phút ở 720C
Sơ đồ 3.2. Quy trình phân lập Staphylococcus aureus kháng Methicillin
3.4.2.4. Phương pháp xác định tính mẫn cảm kháng sinh
Áp dụng phương pháp khoanh giấy kháng sinh.
Sử dụng phương pháp của Kirby-Bauer và đánh giá kết quả thử khả năng mẫn cảm của vi khuẩn với các loại kháng sinh dựa vào bảng đánh giá kết quả của M100-S26 (2007). Mỗi chủng vi khuẩn trước một ngày được cấy vào môi trường thạch thường để tọ ra các khuẩn lạc thuần riêng rẽ. Ủ các đĩa thạch qua đêm ở 370C. Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc hoà tan vào 2ml nước muối sinh lí vô trùng và trộn đều bằng máy trộn Vortex, điều chỉnh để có độ đục tương đương với độ đục của ống so màu Mc Farland 0,5. Sau đó, lấy tăm bông vô trùng thấm huyễn dịch vi khuẩn ria cấy đều trên bề mặt đĩa thạch Muller-Hinton (MH). Đặt khoanh giấy tẩm kháng sinh lên bề mặt đĩa thạch đã được láng vi khuẩn, mỗi đĩa thạch đặt tối đa 5 - 6 loại kháng sinh. Để nuôi cấy ở 370
C/18-24h.
Các loại kháng sinh được sử dụng trong nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.2 dưới đây.
Các bước tiến hành thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh bằng kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh:
Confirmation
Chromagar MRSA
Multiplex PCR
5 khuẩn lạc điển hình (hồng/ hồng tím) 35-37
0
C/24h 1 vòng que cấy 10µl dịch mẫu đã tăng sinh Tăm bông ngoáy mũi của lợn trong 5ml BPW
35-37
0
- Bước 1: Chuẩn bị môi trường thạch Muller - Hinton.
- Bước 2: Các chủng vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường thích hợp được dàn đều lên trên bề mặt môi trường thạch đĩa Muller - Hinton.
- Bước 3: Giấy tẩm kháng sinh của hãng Oxoid được đặt khoảng cách đều nhau trong đĩa.
- Bước 4: Nuôi cấy ở 370C trong 18 - 24h
Đo đường kính vòng vô khuẩn, ghi chép lại kết quả được đọc bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn, ghi lại kết quả của từng loại kháng sinh được thử nghiệm, sau đó so sánh kích thước vòng vô khuẩn của chủng thử nghiệm với vòng vô khuẩn chuẩn tương ứng ở bảng 3.2 để đánh giá mức độ nhạy cảm hay kháng kháng sinh của vi khuẩn.
Sơ đồ 3.3. Quy trình thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh bằng kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh
Bảng 3.2. Bảng đánh giá đƣờng kính vòng vô khuẩn của một số kháng sinh
Phân lập
Cấy chuyển vào môi trường không chọn lọc
Tạo huyễn dịch vi khuẩn trong nước muối sinh lý
Điều chỉnh độ đục chuẩn
Cấy vi khuẩn lên đĩa thạch Mueller-Hinton
Đặt khoanh giấy kháng sinh
Đo vòng kháng khuẩn
Phân tích và trả lời kết quả Khô mặt thạch
dùng trong nghiên cứu
STT Tên kháng sinh Ký hiệu mã hoá Nồng độ kháng sinh Đƣờng kính vòng vô khuẩn R I S 1 Penicillin G P 10 units ≤ 28 - ≥ 29 2 Erythromycin E 15 µg ≤ 13 14 - 22 ≥ 23 3 Linezolid LNZ 30 µg - - ≥ 21 4 Clindamycin DA 2 µg ≤ 14 15 - 20 ≥ 20 5 Norfloxacin NOR 10 µg ≤ 12 13 - 16 ≥ 17 6 Rifampin RD 5 µg ≤ 16 17 - 19 ≥ 19 7 Tetracyclin TE 30 µg ≤ 14 15 - 18 ≥ 19 8 Trimethoprim – Sulfamethoxazole SXT 1.25/23.75 µg ≤ 10 11 - 15 ≥ 16 9 Fusidic acid FD 10 µg ≤18 19-20 ≥21 10 Kanamycin K 30 µg ≤ 13 14 - 17 ≥ 18 Ghi chú: S (Susceptible): Rất mẫn cảm I (Intermediate): Mẫn cảm trung bình R (Resistant): Kháng 3.4.2.5. Phương pháp xử lý số liệu:
Số liệu được ghi chép, xử lý và tính toán trong phần mềm Excel, Mircrosoft Windows.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ ĐIỀU TRA TÌNH HÌNH SỬ DỤNG KHÁNG SINH CHO LỢN TẠI BẮC NINH LỢN TẠI BẮC NINH
Kết quả thu thập thông tin về sử dụng kháng sinh theo sổ ghi chép nhật kí sử dụng thuốc kháng sinh tại hộ chăn nuôi, được người chăn nuôi ghi chép và giữ lại nhãn thuốc đã sử dụng trong thời gian 4 tháng. Sau khi theo dõi sử dụng kháng sinh tại 110 hộ chăn nuôi lợn, chúng tôi tổng hợp thông tin được trình bày tại các bảng sau:
Bảng 4.1. Kết quả tỷ lệ sử dụng thuốc kháng sinh trong điều trị bệnh cho lợn
Số hộ điều tra Số hộ có lợn ốm (Tỷ lệ %) Số hộ không có lợn ốm (Tỷ lệ %) 110 85 (77,3) 25 (22,7) 110 Số hộ sử dụng thuốc kháng sinh để điều trị (Tỷ lệ %) Số hộ không sử dụng thuốc kháng sinh để điều trị (Tỷ lệ %) 77 (70) 8 (7,3)
Kết quả bảng 4.1 cho thấy: trong tổng số 110 hộ chăn nuôi có 85 hộ có lợn bị mắc bệnh trong thời gian thực hiện nghiên cứu chiếm 77,3% và có 25 hộ không có lợn bệnh chiếm 22,7%.
Do chăn nuôi đang có xu hướng tập trung dẫn đến mật độ chăn nuôi ngày càng lớn ảnh hưởng đến tiểu khí hậu chuồng nuôi, trên nền khí hậu nóng ẩm tạo điều kiện cho các mầm bệnh phát triển làm cho vật nuôi ngày càng dễ mắc bệnh hơn.
Trong 85 hộ có lợn bị ốm thì có 77 hộ đã dùng thuốc kháng sinh để điều trị cho lợn ốm chiếm 77,3%, có 8 hộ không sử dụng thuốc kháng sinh để điều trị chiếm 7,3%.
Kết quả nghiên cứu của Dương Thị Toan và cs., (2014) cho biết tại Bắc Giang 100% các trại chăn nuôi có sử dụng kháng sinh với mục đích phòng và điều trị bệnh. Có 94/100 hộ chăn nuôi tại một số xã thuộc tỉnh Thái Bình và huyện Sóc Sơn chiếm 94% số hộ được điều tra có sử dụng thuốc kháng sinh với mục đích điều trị bệnh trong quá trình chăn nuôi một lứa lợn (Nguyễn Thị Vân, 2015). Các kết quả này chứng tỏ rằng kháng sinh được sử dụng rất phổ biến
trong chăn nuôi. Câu hỏi đặt ra là khi nào thì phải sử dụng thuốc kháng sinh cho lợn bị bệnh?
Việc lựa chọn kháng sinh trong điều trị vật nuôi ở Việt Nam, ngoại trừ các trang trại lớn, thì hầu hết việc lựa chọn loại thuốc, quyết định liều lượng, đường đưa thuốc vào cơ thể vật nuôi, thời gian điều trị và ngưng thuốc khi lợn khỏi ốm, phối hợp kháng sinh chủ yếu dựa vào kinh nghiệm của người chăn nuôi và các thông tin thương mại in trên bao bì sản phẩm thuốc thú y (Boisseau, 2002). Khoảng 40% các cơ sở chăn nuôi trên địa bàn tỉnh Bình Dương sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi gà thịt không an toàn (Định Thiện Thuận và cs., 2003). Có 32,6% các cơ sở chăn nuôi gà thịt tại TP. Hồ Chí Minh sử dụng kháng sinh không hợp lệ, 44,5% các cơ sở không ngừng thuốc trước khi giết thịt đúng quy định (Võ Thị Trà An và cs., 2002). Điều này dẫn đến việc sử dụng kháng sinh không hợp lí trong phòng và trị bệnh cho gia súc, gia cầm. Việc sử dụng kháng sinh không hợp lí như vậy có thể tạo ra các sản phẩm chăn nuôi không đảm bảo an toàn cho con người, dẫn tới sự nảy sinh và phát triển về tính kháng thuốc của vi khuẩn (Donovan, 2002).
Nguồn cung cấp các loại kháng sinh cho người dân chăn nuôi chủ yếu là từ các đại lí thuốc thú y tại địa phương hoặc từ bác sĩ thú y, thú y viên hoặc các công ty thuốc thú y về tư vấn và hướng dẫn, khuyến khích người dân sử dụng sản phẩm của đon vị mình.
Sau khi tổng hợp từ sổ ghi chép của người chăn nuôi, các loại kháng sinh được sử dụng trong thời gian theo dõi được thống kê lại theo các nhóm thuốc kháng sinh hiện hành và được trình bảy trong bảng 4.2.
Bảng 4.2. Các loại kháng sinh đƣợc sử dụng trong thời gian điều tra
Số hộ điều tra Số hộ sử dụng kháng sinh Số lấn sử dụng kháng sinh Kháng sinh sử dụng Tần suất sử dụng (Tỷ lệ %) Nhóm β - lactam 9 (9.3) Nhóm Aminoglycosid 7 (7,2) Nhóm Polypeptide 1 (1,0) 110 77 97 Nhóm Macrolide 1 (1,0) Nhóm Lincosamid 6 (6,2) Nhóm Phenicol 1 (1,0) Nhóm Quinolon 11 (11,3) Nhóm Tetracyclin 8 (8,2) Kháng sinh hỗn hợp 53 (54,6)
Từ bảng 4.2 cho thấy: trong 97 lần người chăn nuôi sử dụng thuốc kháng sinh trong điều trị lợn ốm thì có tới 53 lần chiếm 54,6% là sử dụng kháng sinh hỗn hợp tức là thuốc có từ 2 thành phần kháng sinh trở lên kết hợp lại với nhau. Tỷ lệ thuốc kháng sinh đơn được sử dụng ít, chủ yếu là các kháng sinh thuộc nhóm β - lactam và nhóm Quinolon.
Thực tế tại nhiều vùng chăn nuôi, khi cần mua thuốc đề điều trị cho lợn ốm, người chăn nuôi chỉ mô tả một vài triệu chứng hoặc mong muốn tại cửa hàng thuốc thú y, người bán sẽ tư vấn các loại thuốc có thể sử dụng, nhưng vì chưa khẳng định được lợn ốm chính xác là do nguyên nhân gì và để tăng hiệu quả điều trị người bán thuốc thường tư vấn và bán các loại thuốc kháng sinh hỗn hợp. Trong thực tế, các sản phẩm thuốc thú y trên thị trường hiện nay đa phần các công ty đã phối trộn kháng sinh, số lượng kháng sinh đơn thường rất ít. Kháng sinh đơn chủ yếu được bán cho các trang trại chăn nuôi lớn hơn nhưng về họ lại tự phối trộn theo kinh nghiệm hoặc theo tư vấn của các nhân viên kinh doanh của các công ty thuốc. Từ đó dẫn đến việc thuốc kháng sinh được sử dụng tràn lan, khó quản lí. Như vậy, để kiểm soát sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi cần tác động tất cả các yếu tố liên quan, không chỉ mạng lưới thú y mà còn cần nâng cao trình độ nhận thức và trách nhiệm của người bán thuốc và người chăn nuôi.