Phần 4 Kết quả và thảo luận
4.2. Kết quả phân lập vi khuẩn Staphylococcus aureus và vi khuẩn
VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS KHÁNG METHICILLIN
Từ kết quả điều tra, trong 77 hộ có sử dụng thuốc kháng sinh trong điều trị khi lợn bị ốm, chúng tôi chọn ra 21 hộ có số lần sử dụng kháng sinh nhiều hơn tiến hành lấy 82 mẫu tăm bông ngoáy mũi lợn để kiểm tra sự có mặt của
Staphylococcus aureus và Staphylococcus aureus kháng Methicillin và khả năng mẫn cảm kháng sinh của chúng với một số kháng sinh đang được sử dụng.
4.2.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Staphylococcus aureus
Sau khi tiến hành lấy 82 mẫu tăm bông ngoáy mũi từ 82 con lợn của 21 hộ chăn nuôi trên địa bàn tỉnh Bắc Ninh chúng tôi tiến hành phân lập vi khuẩn S. aureus và kết quả thu được tại bảng sau:
Bảng 4.4. Kết quả phân lập S. aureus trên môi trƣờng thạch Baird Parker
Lần kiểm tra Số mẫu kiểm tra Số mẫu (+)* Tỷ lệ (%)
1 22 3 3,66
2 30 10 12,2
3 30 14 17,07
Tổng 82 27 32,93
Ghi chú: *: mẫu (+) là những mẫu tìm thấy khuẩn lạc có màu đen nhánh, bóng, lồi, đường kính 1 - 1,5 mm, quanh khuẩn lạc có quầng sáng rộng 2 - 5 mm
Từ 27 mẫu dương tính này, mỗi mẫu lựa chọn 1 - 3 khuẩn lạc điển hình để tiếp tục làm các phản ứng sinh hoá để khẳng định sự có mặt của S. aureus. Kết quả sinh hoá được tổng hợp ở bảng 4.5.
Bảng 4.5. Kết quả kiểm tra đặc tính sinh học của một số chủng
Staphylococcus spp phân lập đƣợc
STT Chỉ tiêu kiểm tra Số chủng kiểm tra dƣơng tính Số chủng Tỷ lệ + (%)
1 Bắt màu Gram + 55 55 100
2 Lên men đường Mannitol 55 14 25,45
3 Catalaze (+) 55 55 100
4 Coagulase (+) 55 12 21,82
Từ bảng 4.5. ta thấy: 55/55 chủng (100%) nhuộm gram cho kết quả là các tụ cầu khuẩn, đứng thành đám, hình chùm nho, bắt màu gram +, 100% các chủng được kiểm tra có phản ứng catalase dương tính, 14/55 (25,45%) chủng được kiểm tra lên men đường Mannitol, chỉ có 12 chủng chiếm 21,82% là cho phản ứng coagulase dương tính. 12 chủng này được xác nhận là tụ cầu khuẩn S. aureus.
Khi nghiên cứu về Staphylococcus người ta có chia ra 2 nhóm là nhóm tụ cầu có men coagulase và nhóm tụ cầu không có men coagulase. S. aureus thuộc nhóm tụ cầu có men coagulase do S. aureus sản xuất 2 loại men coagulase là coagulase ngoại bào phản ứng với prothrombin huyết tương và coagulase liên kết, kết dính với thành phần vi khuẩn, phản ứng với chất ức chế huyết tương để gây ra hiện tượng đông máu. Phản ứng đông huyết tương là phản ứng tiêu chuẩn để phân biệt S. aureus với các chủng tụ cầu khác. Từ kết quả của bảng kiểm tra đặc tính sinh học các chủng Staphylococcus spp phân lập được, chúng tôi khẳng định có 12 chủng thuộc 11 mẫu kiểm tra ô nhiễm với vi khuẩn S. aureus. Kết quả được thể hiện qua hình 4.1.
Hình 4.1. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Staphylococcus aureus ở hộ chăn nuôi lợn tại Bắc Ninh
13.41%
86.59%
Tỷ lệ nhiễm Tỷ lệ không nhiễm
Từ kết quả của hình 4.1 cho thấy tỷ lệ nhiễm S. aureus 13,41%. Kết quả này có sự khác biệt so với một số nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm S. aureus trong các bệnh viện nhân y. Trong nghiên cứu của Vũ Ngọc Hiếu và cs., 2017, trên 487 bệnh nhân đái tháo đường có bệnh phẩm nhiễm trùng da và mô mềm dương tính với vi khuẩn tỷ lệ nhiễm S. aureus là 32,4%. Tỷ lệ nhiễm S. aureus trong 6 loại vi khuẩn thường gặp nhất trong các loại nhiễm khuẩn bệnh viện là 7,66% (Nguyễn Thanh Bảo và cs., 2011).
Staphylococcus aureus được xem là một trong ba tác nhân chính của các vụ ngộ độc thực phẩm ở nhiều nước chỉ sau Salmonella và Clostridium perfringens (Rosec et al., 1996; Fueyo et al., 2000; Viktoria et al., 2011; Normanno et al., 2005). Triệu chứng ngộ độc xảy ra nhanh, từ 3 - 6 giờ sau khi ăn thực phẩm bị nhiễm, tuỳ vào lượng thực phẩm đã dùng, lượng độc tố có trong thực phẩm và độ nhạy với độc tố cũng như sức khoẻ của từng người. Tuy thời gian gây bệnh ngắn nhưng những vụ ngộ độc thực phẩm do tụ cầu để lại hậu quả không nhỏ. Theo đánh giá của tổ chức y tế thế giới, hàng năm Việt Nam có khoảng trên ba triệu ca ngộ độc thực phẩm, gây tổn hại trên 200 triệu USD. Trong những năm gần đây, số vụ ngộ độc thực phẩm ở nước ta ngày càng gia tăng. Theo số liệu từ cục Quản lí chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm, trong những vụ dịch được tổng kết từ năm 1997 đến 2002 thì ngộ độc thực phẩm do tác nhân vi sinh vật chiếm tỷ lệ cao từ 40 - 45% trong các loại gây ngộ độc, trong số đó có nhiều vụ được xác định tác nhân là Staphylococcus aureus
(Nguyễn Đỗ Phúc và cs., 2003). Mới đây Staphylococcus aureus được xác nhận là nguyên nhân gây ra vụ ngộ độc khiến 136 người nhập viện sau khi ăn tiệc cưới tại Di Linh, Lâm Đồng vào ngày 23 tháng 5 năm 2019 (Anh Kiệt, Dân Việt).
Enterotoxin là dạng độc tố chịu nhiệt gây bệnh đường ruột thường gặp trong các vụ ngộ độc thực phẩm liên quan đến tụ cầu nó là những loại protein tương đối chịu nhiệt, không bị phân hủy bởi sự đun nấu và nó đề kháng với sự đun sôi trong 30 phút cũng như tác động của enzyme ở ruột. Đa số các dòng S. aureus có thể tổng hợp một hay nhiều enterotoxin, từ đó có thể nhận thấy nguy cơ nhiễm S. aureus ở lợn ảnh hưởng lớn tới sức khoẻ cộng đồng. Vì trong quá trình chăn nuôi hay giết mổ, S. aureus rất dễ dàng nhiễm vào thân thịt và nếu không kiểm soát tốt nguy cơ gây nên ngộ độc thực phẩm là rất cao. Cần phải
thực hiện quá trình chăn nuôi, kiểm soát giết mổ tốt để tránh sự lây lan và gây nhiễm của S. aureus.
4.2.2. Kết quả phân lập vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng Methicillin
Chúng tôi tiến hành phân lập đồng thời vi khuẩn MRSA cùng với vi khuẩn
S. aureus. Sau khi 82 mẫu tăm bông ngoáy mũi lợn được tăng sinh trong 5ml BPW, sau 24h lấy 1 vòng que cấy 10µl dịch mẫu đã tăng sinh cấy vào môi trường đặc hiệu Chrom agar và nuôi cấy trong tủ ấm 370C trong 24h. Kết quả khuẩn lạc dương tính trên môi trường Chrom agar được thể hiện ở bảng 4.6.
Bảng 4.6. Kết quả phân lập MRSA trên môi trƣờng Chromagar MRSA
Lần kiểm tra Số mẫu kiểm tra Số mẫu (+)* Tỷ lệ (%)
1 22 3 3,66
2 30 7 23,33
3 30 12 17,07
Tổng 82 22 32,93
Ghi chú: * mẫu (+) là mẫu có khuẩn lạc tròn, trơn có màu hồng hoặc hồng tím
Từ 22 mẫu nghi ngờ dương tính, chúng tôi chọn ra 54 khuẩn lạc tiếp tục tiến hành khẳng định sự có mặt của MRSA bằng phản ứng multiplex PCR . Kết quả được tổng hợp trong bảng sau:
Bảng 4.7. Kết quả kiểm tra MRSA bằng kỹ thuật Multiplex PCR
Multiplex PCR Số chủng kiểm tra Kết quả (+) Tỷ lệ (%)
Gen spa 54 16 29,63
Gen plv 54 0 0
Gen mecA 54 8 14,81
Gen mecALGA252 54 0 0
Xác nhận 54 8 14,81
Qua kết quả kiểm tra tìm thấy có 16 chủng mang gen spa, 8 chủng mang gen mecA, không tìm được chủng nào mang gen plv và mecALGA252. Xác nhận lại có 8 chủng thuộc 5 mẫu được xác định là MRSA.
Hình 4.2. Kết quả kiểm tra bằng phản ứng Multiplex PCR một số chủng MRSA phân lập đƣợc tại tỉnh Bắc Ninh
Hình 4.3. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn MRSA ở hộ chăn nuôi lợn tại Bắc Ninh
Qua hình ta thấy 5 mẫu trên 82 mẫu nhiễm MRSA (6,1%). Nghiên cứu về vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng Methicillin ở lợn và người chăn nuôi lợn tại Otario, Canada tiến hành năm 2007 cho kết quả tỷ lệ lưu hành vi khuẩn MRSA trên lợn tại đây là 24.9% (71/285 mẫu). Có sự khác biệt giữa 2 kết quả có thể do loại mẫu thu thập và thời điểm thu thập mẫu tại mỗi môi trường khác nhau. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu về vi khuẩn MRSA ở Châu Âu thực hiện từ năm 1999-2002 chỉ ra tỷ lệ nhiễm MRSA thấp nhất ở Bắc Âu và tỷ lệ mắc cao nhất ở miền nam châu Âu, cụ thể là thấp nhất ở Iceland (0.5%) và cao
6.1%
93.9%
Tỷ lệ nhiễm Tỷ lệ không nhiễm
nhất ở Hy Lạp (44%). Các nước khác có tỷ lệ nhiễm MRSA như sau: Úc (8.8%), Croatia (36.7%), Italya (40,9%),... Trong nghiên cứu chỉ ra tỷ lệ MRSA tăng đáng kể ở Bỉ (từ 22% năm 1999 lên 27% năm 2002), Ireland (39% - 45%), Đức (9 % - 19%), Hà Lan (0,4% - 1%) và Vương quốc Anh (31% - 45%). Tỷ lệ MRSA chỉ giảm đáng kể ở Slovenia, từ 22% năm 2000 xuống 15% năm 2002 (Edine W Tiemersma, Stef Lam Bronzwaer et al., 2004).