campisalis TT8.5
a. Thiết lập mô hình thí nghiệm
Từ quá trình khảo sát các điều kiện thích hợp chủng vi khuẩn Virgibacillus campisalis TT8.5, chúng tôi tiến hành xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu cho
chủng vi khuẩn dựa vào kết quả thí nghiệm xác định các khoảng ảnh hưởng của các đơn yếu tố. Qua các kết quả nghiên cứu chúng tôi xây dựng điều kiện thí nghiệm với hàm mục tiêu là mật độ quang của chủng vi khuẩn đo tại bước sóng 620nm, ở thời điểm chúng phát triển mạnh nhất, sinh khối lớn nhất. Các điều kiện nuôi cấy chủng vi khuẩn được thể hiện ở bảng 4.7.
Bảng 4.7. Bảng mã hóa và khoảng biến thiên của các yếu tố nghiên cứu của chủng TT8.5
Biến số Mã hóa Đơn vị Kí hiệu giá trị mã hóa Khoảng biến thiên
-1 0 +1
Nhiệt độ X 0C 32 37 42 5
pH Y 7.5 8 8.5 0.5
Nồng độ muối Z % 2 5 8 3
Kết quả thực nghiệm nuôi cấy chủng vi khuẩn theo quy hoạch thực nghiệm bậc 2 Box-Behnken với 3 yếu tố nhiệt độ, pH và nồng độ muối và hàm mục tiêu là mật độ quang đo được của chủng vi khuẩn tại thời điểm chủng phát triểm mạnh mẽ nhất. Tiến hành xây dựng hàm hồi quy bậc 2 cho hàm mục tiêu như sau:
OD= b0 + b1X + b2Y + b3Z + b11X2 + b22Y2 + b33Z2 + b12XY + b13XZ + b23YZ
Trong đó: Các hệ số hồi quy: b1, b2, b3, b11, b22, b33, b12, b13, b23; Yếu tố thí nghiệm cần tối ưu: X; Y; Z;
Yếu tố đầu ra: Abs620nm - giá trị mật độ quang thể hiện sinh khối vi khuẩn được tạo thành.
Từ điều kiện thí nghiệm ở bảng 4.7, chúng tôi xây dựng mô hình thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy chủng vi khuẩn Virgibacillus campisalis TT8.5 với
sự hỗ trợ của mô hình Box Behnken (BBD- Box-Behnken Design). Mỗi thí nghiệm được lặp lại 2 lần, mô hình gồm 15 thí nghiệm. Kết quả được trình bày ở bảng 4.8.
Bảng 4.8. Bảng ma trận mã hóa theo mô hình thiết kế thí nghiệm Box- Behnken và kết quả thực nghiệm của chủng TT8.5
Công thức Biến số Abs620nm tại thời điểm 96h Nhiệt độ (X, oC) pH (Y) Nồng độ muối (Z, %) 1 32 7.5 5 5,6168 2 42 7.5 5 1,1841 3 32 8.5 5 6,1010 4 42 8.5 5 1,2010 5 32 8.0 2 6,6048 6 42 8.0 2 1,2746 7 32 8.0 8 5,7653 8 42 8.0 8 1,1503 9 37 7.5 2 6,6649 10 37 8.5 2 5,6737 11 37 7.5 8 3,5566 12 37 8.5 8 4,0210 13 37 8.0 5 4,6771 14 37 8.0 5 4,7759 15 37 8.0 5 4,6867
b. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy chủng vi khuẩn Virgibacillus campisalis TT8.5
Để đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố: nhiệt độ, pH và nồng độ muối ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn. Kết quả phân tích phương sai và tính phù hợp của mô hình được thể hiện ở bảng 4.9.
Bảng 4.9. Kết quả phân tích ANOVA cho mật độ đo quang của chủng vi khuẩn Virgibacillus campisalis TT8.5
Biến DF Hệ số hồi quy Tổng bình phương Trung bình bình phương F P Regression 9 4,63 56,1443 6,2383 62,13 ≤ 0,0001 ý nghĩa Nhiệt độ 1 -2,54 51,4653 51,4653 512,58 ≤ 0,0001 pH 1 -0,12 0,1124 0,1124 1,12 0,338 Nồng độ muối 1 -0,33 0,8965 0,8965 8,93 0,031 Nhiệt độ*nhiệt độ 1 -0,94 3,2338 3,2338 32,21 0,002 pH*pH 1 -0,03 0,0041 0,0041 0,04 0,848 Nồng độ muối*nồng độ muối 1 -0,09 0,0313 0,0313 0,31 0,601 Nhiệt độ*pH 1 -0,13 0,0657 0,0657 0,65 0,455 Nhiệt độ*nồng độ muối 1 0,11 0,0484 0,0484 0,48 0,518 pH*nồng độ muối 1 0,22 0,1896 0,1896 1,89 0,228 Phần dư 5 0,502 0,1004 Sai số mô hình (LoF) 3 0,4583 0,1528 6,99 0,128 không có ý nghĩa Sai số ngẫu nhiên 2 0,0437 0,0219 Tổng 15 R2xác định = 99,11% R2hiệu chỉnh = 97,52%
Quá trình sinh trưởng và phát triển của chủng vi khuẩn được xây dựng dựa trên mật độ quang đo được qua quá trình nuôi cấy. Để xác định sự ảnh hưởng của các yếu tố đến sự phát triển của các chủng vi khuẩn, chúng tôi sử dụng phần mềm minitab và JMP để xử lí và phân tích kết quả thực nghiệm. Kết quả phân tích thống kê ở bảng 4.9 cho thấy, giá trị của hệ số R2 xác định = 99,11% và R2hiệu chỉnh = 97,52%, hệ số xác định cho biết, có 99,11% sự biến thiên của giá trị Abs620nm qua quá trình nuôi cấy là do tác động của các biến độc lập: nhiệt độ, pH và nồng độ muối bổ sung vào môi trường nuôi cấy, chỉ có 0,89% do các yếu tố bên ngoài không xác định tác động vào (sai số ngẫu nhiên).
Mức độ phù hợp of fit. Mô hình tương qu vậy, mô hình được kiểm thống kê là điều mong m 0,128 cho thấy Lack of hợp của mô hình là rấ dựng được phương tr chủng vi khuẩn và các y OD1 = 4,63 – 0,13XY + 0,11XZ + 0, Mô hình có R2 99,11% so với thực tế. Kết quả thí nghiệ ảnh hưởng đến sự sinh tương tác của các yếu t thích bằng phương trình nhất bậc 1 đến sự sinh càng tăng, chủng vi khu nồng độ muối cũng ảnh của chủng vi khuẩn, ảnh của ba yếu tố thí nghiệ đoán hiệu suất trích li, k
Hình 4.11. Điều ki
ợp của mô hình được đánh giá thông qua gi ơng quan tốt cần sự phù hợp giữa số liệu thực t c kiểm định Lack of fit (sự không phù hợp) k ong muốn (Zabeti et al., 2009). Từ bảng phân ack of fit không thể hiện ý nghĩa thống kê, nê ất cao. Từ kết quả ước lượng hệ số hồi qu ng trình mô tả mối tương quan giữa tốc độ à các yếu tố thí nghiệm như sau:
2,54X – 0,12Y – 0,33Z – 0,94X2 + 0, ,22YZ.
2 = 0,9911 chứng tỏ mô hình của chúng c tế.
í nghiệm cho thấy, cả ba nhân nhiệt độ, pH, nồ ự sinh trưởng và phát triển của chủng vi khu yếu tố đến tốc độ sinh trưởng của chủng vi k
ình hồi quy. Nhiệt độ nuôi cấy có ảnh hư ự sinh trưởng và phát triển của chủng vi khuẩ
vi khuẩn phát triển càng chậm. Tương tự, pH củ g ảnh hưởng tiêu cực bậc một đến sự sinh trư ẩn, ảnh hưởng tích cực bậc hai. Để xác định đ nghiệm, điểm kì vọng sẽ được tối ưu hóa s ch li, kết quả được thể hiện trên hình 4.11.
u kiện nuôi cấy tối ưu của chủng vi khuẩn
campisalis TT8.5
qua giá trị F của Lack thực tế và lí thuyết, vì ợp) không có ý nghĩa g phân tích số liệu F = kê, nên khả năng phù i quy chúng tôi xây ộ sinh trưởng của ,03Y2 + 0,09Z2 – chúng tôi mô tả đúng pH, nồng độ muối đều vi khuẩn. Ảnh hưởng ng vi khuẩn được giải ưởng tiêu cực lớn i khuẩn. Khi nhiệt độ pH của môi trường và ưởng và phát triển ịnh được giá trị tối ưu óa sử dụng độ thị dự