Để làm giảm hàm lượng histamine trong thực phẩm, trên thế giới đã có nhiều phương pháp được áp dụng Renes et al. (2014) tổng kết và đưa ra 2
phương pháp chính:
- Thứ nhất là kiểm soát chất lượng nguyên liệu, đảm bảo vệ sinh trong quá trình sản xuất;
- Thứ hai là thực hiện các tác động công nghệ trong quá trình sản xuất.
2.2.3.1. Kiểm soát chất lượng nguyên liệu, đảm bảo vệ sinh trong quá trình sản xuất
Các phương án kiểm soát tập trung vào việc xử lý và bảo quản nguyên liệu (Renes et al., 2014). Tiếp đó là việc duy trì chất lượng vệ sinh của nguyên liệu, đảm bảo điều kiện vệ sinh trong toàn bộ quá trình sản xuất, và áp dụng các điều kiện ức chế sự phát triển của các vi sinh vật có khả năng sinh enzyme amino acid decarboxylase. Áp dụng thực hiện hiệu quả kế hoạch HACCP, GHP (Good Hygiene Practices), GMP có thể giải quyết các vấn đề trên.
Tuy nhiên, một khi các enzyme decarboxylase đã được sinh ra, chúng có thể tiếp tục chuyển hóa amino acid thành các amine nếu như không áp dụng biện pháp công nghệ để kìm hãm chúng. Bên cạnh đó nếu chỉ đảm bảo vệ sinh đơn thuần, trong khi các biến đổi vật lý và hóa học của nguyên liệu vẫn diễn ra, sẽ góp phần thúc đẩy sự tấn công của các vi sinh vật và làm tăng hoạt tính sinh amine.
Chính vì vậy, đối với việc kiểm soát phải bao gồm cả việc ngăn ngừa các biến đổi vật lý, hóa học của nguyên liệu trước khi chế biến. Tại Mỹ, Cục Thực phẩm và Dược phẩm đã thường xuyên cung cấp các hướng dẫn việc vận chuyển và bảo quản các sản phẩm thủy sản nhằm phòng tránh các nguy cơ liên quan đến sức khỏe, trong đó bao gồm có nguy cơ về histamine (FDA, 2001).
2.2.3.2. Các tác động công nghệ ngăn ngừa sự hình thành, tích tụ histamine
phẩm thực phẩm ngay khi chúng được hình thành, thậm chí với việc xử lý nhiệt như hấp tiệt trùng (Luten et al., 1992). Ngoài ra, không thể phát hiện histamine
bằng phương pháp cảm quan. Rất nhiều các hướng nghiên cứu đã được tiến hành nhằm giảm hàm lượng histamine cũng như các amine sinh học khác trong thực phẩm. Các phương pháp chủ yếu được sử dụng bao gồm phương pháp vật lý, phương pháp hóa học, và phương pháp vi sinh vật.
- Phương pháp vật lí: Sử dụng phương pháp chiếu xạ, áp suất thủy tĩnh cao hoặc thay đổi thành phần khí trong bao gói sản phẩm đã được nghiên cứu sử dụng để làm giảm hàm lượng histamine trong thực phẩm (Naila et al., 2010).
Dựa trên ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt các vi khuẩn sinh amine và ức chế hoạt tính của enzyme decarboxylase các amino acid. Phương pháp này có hiệu quả và độ chắc chắn cao nhưng nó lại gây ra các nguy cơ có hại cho sức khỏe do có thể tạo ra các hợp chất mang gốc tự do (Naila et al., 2010; Kim et al., 2004). Ngoài ra chi phí cho phương pháp này lớn.
- Phương pháp hóa học: Mối liên hệ giữa chất bảo quản và phụ gia thực phẩm tới hàm lượng của các amine sinh học trong thực phẩm cũng đã được nghiên cứu. Việc sử dụng các hóa chất có đặc tính kháng khuẩn có thể thay đổi thành phần và hàm lượng các amine trong thực phẩm bằng cách tác động vào sự cân bằng của hệ vi khuẩn trong thực phẩm đó, hơn là khả năng tác động trực tiếp đến hoạt tính decarboxylase của vi khuẩn (Gardini et al., 2016). Tuy nhiên, vai
trò của các chất bảo quản (kháng khuẩn) đối với việc hạn chế sự hình thành histamine trong thực phẩm vẫn còn chưa rõ ràng và liều lượng sử dụng hạn chế, giá thành cao.
- Phương pháp vi sinh vật: Việc sử dụng vi khuẩn trong sản xuất thực phẩm nhằm hạn chế sự tích tụ histamine trong thực phẩm gồm 2 hướng: Sử dụng các chủng khởi động (starter culture) trong sản phẩm lên men và bổ sung các chủng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa, phân giải histamine. Hiện nay, việc ứng dụng các vi khuẩn có chứa các enzyme phân giải histamine là một phương pháp hữu hiệu trong việc giảm hàm lượng histamine trong thực phẩm lên men, qua các nghiên cứu có thể nhận thấy sử dụng vi sinh vật trong quá trình làm giảm histamine là hướng đi có tính khả thi cao, với tỷ lệ phân giải histamine đạt khoảng trên 30%, mặt khác sử dụng vi sinh vật thường có chi phí thấp, không cần trang thiết bị đặc biệt.
2.2.3.3. Một số nghiên cứu về vi sinh vật phân giải histamine
Histamine được phân giải thông qua quá trình oxy hóa tách nhóm amine được xúc tác bởi enzyme histamine oxidase hoặc histamine dehydrogenase được sinh ra từ một số vi sinh vật. Hiện nay, việc ứng dụng các vi khuẩn có chứa các enzyme phân giải histamine đang nổi lên như là một phương pháp hữu hiệu trong việc giảm hàm lượng histamine trong thực phẩm lên men.
Tình hình nghiên cứu trong nước
Trong một đề tài nghiên cứu rất mới đây, các nhà nghiên cứu thuộc Đại học Nha Trang đã nghiên cứu xác định khả năng sinh histamine của một số vi khuẩn phân lập từ chượp cá cơm trong quá trình sản xuất nước mắm truyền thống. Bởi theo các tác giả này, thực trạng hàm lượng histamine trong nước mắm truyền thống dao động từ 1000 – 3000 mg/l, cao gấp nhiều lần so với tiêu chuẩn Codex 302-2011 là 400 mg/L mà hiện nay thì chưa có giải pháp hữu hiệu nào được đưa ra nhằm giải tỏa tình hình này (Đào Thị Ngà, 2016).
Có một nghiên cứu của Dang Thao Yen Linh et al. (2018) cũng chỉ nghiên
cứu về những vi khuẩn có khả năng sinh histamine từ quá trình lên men của nước mắm Cát Hải.
Tuy nhiên, nghiên cứu tuyển chọncác chủng có khả năng phân giải histamin ở trong nước còn rất hạn chế. Vì vậy mà việc nghiên cứu khả năng phân giải histamine trong nước mắm truyền thống trở nên vô cùng cấp thiết.
Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Trong thực phẩm
Renes et al. (2014) đã tìm thấy sự giảm hàm lượng amine hữu cơ giảm đáng kể khi sử dụng Lactococcus lactis trong quá trình ủ chín pho mát được làm từ
sữa cừu. Kết quả này cũng đã khẳng định quan sát của Novella-Rodríguez (2002) trong pho mát làm từ sữa dê. Latorre-Moratalla et al. (2012) cũng cho
thấy khi sử dụng L. sakei và L. curvatus phân lập từ thịt lên men đã đáp ứng
tốt đối với xúc xích lên men. Việc sử dụng hỗn hợp chủng có tác dụng tốt hơn so với sử dụng đơn lẻ một chủng (Latorre-Moratalla et al., 2010b; Naila et al., 2010). Đặc biệt là trong xúc xích lên men, các chủng tự nhiên thể hiện khả năng làm giảm các amine cao hơn so với các chủng thương mại (Latorre- Moratalla et al., 2010).
Theo Gardini et al
có thể có vai trò quan tr học, và cần có thêm n Tabanelle et al. (2014 của L. lactis có khả năn và Enterococcus faecali Histamine được p (oxidative deamination histamine dehydrogenas Hình 2.4. Ph - Hình 2.5. Phản Leuschner et al. ( thể của Kocuria (trước đ chủng Brevibacterium
giảm hàm lượng amine Hammes, 1998).
Hoạt tính amin
amyloliquefaciens và Ba
khuẩn lactic, rất nhiều lo thể hiện khả năng này tr tính này cũng được q
et al. (2016), việc sử dụng các chủng lactic s
uan trọng và tiềm năng trong việc hạn chế sự hêm những nghiên cứu để làm rõ tiềm năng 2014) đã chứng minh việc sử dụng các chủng s năng hạn chế sự tạo ra histamine bởi chủng
ecaliss.
c phân giải thông qua quá trình oxy hóa tá nation) được xúc tác bởi enzyme histamin ogenase được sinh ra từ một số vi sinh vật (hình
Phản ứng xúc tác bởi enzyme diamine ox
n ứng xúc tác bởi enzyme histamine dehyd
. (1998) đã tìm thấy các enzyme này trong
c đây là Micrococcus). Ngoài ra, họ cũng ph
ium linens sinh enzyme amine oxidase, sau
amine hữu cơ trong sản xuất pho mát Munster amine oxidase cũng được tìm thấy
Bacillus subtilis (Zaman et al., 2010, 2011)
u loài của giống Lactobacillus, Pediococcus này trong môi trường nuôi cấy (García-Ruiz et c quan sát in vitro ở Lactobacillus case
lactic sinh bacteriocins tích tụ amine sinh năng này. Trước đó, ng sinh bacteriocins ng S. thermophilus
hóa tách nhóm amine stamine oxidase hoặc t (hình 2.4 và 2.5).
ine oxidase
dehydrogenase
trong hầu hết các biến ũng phân lập được các e, sau đó sử dụng để unster (Leuschner and y trong Bacillus
1). Trong nhóm vi
ccus, và Oenococcus et al., 2011). Hoạt casei, Lactobacillus
plantarum (Fadda et al., 2001; Herrero-Fresno et al., 2012), và ở L. sakei trong
dịch cá lên men (Dapkevicius et al., 2000). Bên cạnh đó, Herrero-Fresno et al. (2012) đã chứng minh việc sử dụng hai chủng của loài L. casei có tốc độ phân
giải histamine và tyramine cao làm giảm đáng kể hàm lượng các chất này trong pho mát.
Martuscelli et al. (2000) đã xác định được tới 40 chủng trong 50 chủng
phân lập được từ xúc xích lên men có khả năng phân giải histamine, trong đó, các chủng S81, S206, S79, và S90 thể hiện khả năng oxy hóa histamine cao nhất với khả năng phân giải lần lượt là 100%, 93%, 68% và 53%.
Trong nước mắm
Trong nghiên cứu của Lee et al. (2015, 2016), chủng vi khuẩn có khả năng
phân giải histamine là Bacillus polymyxa D05-1 được phân lập từ cá mòi muối (salted sardine). Chúng thể hiện khả năng phân giải 100% histamine trong canh trường TSB (TSB broth-trypticase soy broth) sau 24h ở điều kiện nhiệt độ 25- 37ºC, pH = 7-9 và nồng độ NaCl 0,5 – 5%. Sau đó, chủng này được bổ sung vào cá mòi trước khi lên men với tỷ lệ 10% (107cfu/ml). Sau khi lên men ở 35⁰C trong 120 ngày ở điều kiện nồng độ muối cao 17,5-17,8%, hàm lượng histamine trong sản phẩm giảm 34% so với mẫu đối chứng. Trong dung dịch đệm phosphate 0,05M pha 100ppm histamine, sau 24 ở 37ºC, Staphylococcus carnosus phân lập từ nước mắm phân giải được 29,1% histamine so với lượng
ban đầu (Zaman et al., 2010).
Năm 2011, các nhà khoa học Malaysia đã công bố những kết quả khả quan trong việc bổ sung các chủng vi khuẩn có hoạt tính amine oxidase trong quá trình lên men nước mắm nhằm giảm hàm lượng histamine cũng như một số amine sinh học khác. Hai chủng vi khuẩn Staphylococcus carnosus FS19 và Bacillus amyloliquefaciens FS05 được phân lập từ nước mắm, có hoạt tính amine oxidase,
được bổ sung riêng rẽ vào hỗn hợp cá cơm + 15% muối với tỷ lệ chủng chiếm 10% so với nguyên liệu (1 ml dịch vi khuẩn chứa 107 tế bào) trước khi lên men. Trong quá trình lên men ở 35ºC trong 120 ngày, các mẫu được lấy định kỳ sau 5 ngày và sau đó là 20 ngày để phân tích thành phần hóa học và vi sinh. Kết quả nghiên cứu cho thấy trong tất cả các mẫu nước mắm, pH tăng dần trong quá trình lên men (từ khoảng 5,5 đến 7,3), trong khi hàm lượng muối gần như không thay đổi (15-16%). Số lượng vi khuẩn hiếu khi giảm do bị ức chế phát triển bởi nồng
độ muối cao trong suốt quá trình lên men. Số lượng vi khuẩn sinh histamine ở mẫu bổ sung chủng tương tự so với mẫu đối chứng. Cùng với đó là hàm lượng histamine tăng dần trong quá trình lên men và tăng nhanh nhất sau 5 ngày đầu tiên lên men ở cả 3 mẫu. Tuy nhiên, hàm lượng histamine trong 2 mẫu bổ sung chủng Staphylococcus carnosus FS19 và Bacillus amyloliquefaciens FS05 thấp
hơn lần lượt là 27,7% và 15,4% so với mẫu đối chứng.
Trong nghiên cứu của Lee et al. (2012), Virgibacillus campisalis sp được phân lập từ ruộng muối ở Hàn Quốc có điều kiện tối ưu cho chủng vi khuẩn này phát triển ở pH 7,5 – 8, nhiệt độ ở 37ºC và nồng độ muối từ 4-5%.
Trong nghiên của Ramesh & Pandey (2016), chủng Exiguobacterium có điều kiện tối ưu cho chủng này phát triển ở pH 7 – 8, nhiệt độ ở 35-40ºC và nồng độ muối từ 1-9%.
Vậy với những nghiên cứu tổng quan ở trên, đề tài tiếp theo sẽ sử dụng các ngưỡng nghiên cứu đơn yếu tố cho vi khuẩn lựa chọn để tăng sinh khối với điều kiện: pH từ 6,5 – 8,5; nhiệt độ từ 32-47ºC và nồng độ muối từ 2-15% (theo Lee
PHẦN 3. ĐỐI TƯỢNG – NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
28 chủng vi khuẩn chịu mặn được phân lập từ chượp mắm tại Hải Phòng và Nam Định.
STT Tên chủng Địa điểm Loại cá Thời điểm chượp (tháng)
1 CH2.1 Hải Phòng Cá quẩn 2 2 CH3.3 3 3 CHN6.1 6 4 CT13.1 Nam Định Cá cơm 13 5 CT13.2 13 6 CT14.1 14 7 CT14.2 14 8 LT6.1 Cá lâm 6 9 LT6.3 6 10 LT8.2 8 11 LT9.2 9 12 Nh1.1 Cá nhâm 1 13 Nh1.2 1 14 Nh1.3 1 15 Nh3.1 3 16 Nh3.3 3 17 Nh5.2 5 18 Nh6.2 6 19 Nh6.5 6 20 TT12.2 Cá trích 12 21 TT8.1 8 22 TT8.5 8 23 TT8.6 8 24 TT8.6 8 25 TT9.1 9 26 TT9.2 9 27 TT9.3 9 28 TT9.6 9
3.1.2. Địa điểm, thời gian nghiên cứu
- Địa điểm thực hiện: Phòng thí nghiệm Trung tâm khoa học và Công nghệ thực phẩm, khoa Công nghệ thực phẩm – Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam.
- Thời gian thực hiện đề tài: 3/2019 – 10/2019.
3.1.3. Dụng cụ
- Dụng cụ: pipet các loại, pipet man 1ml, pipet man 0,1 ml; bình tam giác các loại, đĩa petri, ống nghiệm, giá để ống nghiệm, phễu chiết, bình định mức các loại, lam kính, ống fancol, ống eppendorf, bút viết kính, túi bóng kính, màng bọc thực phẩm, đèn cồn, que cấy chang, que cấy ria,…
3.1.4. Môi trường nuôi cấy
- Môi trường halophilic (HA): môi trường dinh dưỡng phân lập và nuôi cấy vi khuẩn chịu mặn (g/l): NaCl (250), cao nấm men (5), KCl (2), sodium glutamate (1), trisodium citrate (3), MgSO2.7H2O (20), FeCl3 (0.036), MnCl2.4H2O (0.00036), Agar (20), pH = 7.2 ± 0.2, hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút.
- Môi trường lỏng halophilic: thành phần như môi trường halophilic nhưng không có agar dùng để nuôi vi khuẩn.
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Tuyển chọn chủng có khả năng phân giải histamine cao từ 28 chủng vi khuẩn chịu mặn được phân lập từ chượp mắm Hải Phòng và Nam Định;
- Định danh chủng vi khuẩn phân giải histamine cao đã tuyển chọn trên bằng sinh học phân tử;
- Ảnh hưởng của điều kiện đơn yếu tố và tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy của chủng vi khuẩn đã được tuyển chọn:
+ Ảnh hưởng điều kiện đơn yếu tố (pH, nhiệt độ, nồng độ muối) đến khả năng sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn;
+ Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy của chủng vi khuẩn theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm đa yếu tố.
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1. Bố trí thí nghiệm 3.3.1. Bố trí thí nghiệm
Ảnh hưởng của các đơn yếu tố đến sinh trưởng của chủng vi khuẩn
Bố trí các thí nghiệm một nhân tố
Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ muối đến sinh trưởng của vi khuẩn
Yếu tố phi thí nghiệm: - Môi trường nuôi cấy: HA; - pH: 7;
- Nhiệt độ: 37oC; - Tốc độ vòng: 200v/p.
Yếu tố thí nghiệm: Mức nồng độ muối 2%; 5%; 8%; 12%; 15%;
Chỉ tiêu theo dõi: Đánh giá khả năng tăng sinh khối của vi khuẩn qua mật độ quang của tế bào ở bước sóng 620nm tại các thời điểm 0, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 (h).
Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sinh trưởng của vi khuẩn
Yếu tố phi thí nghiệm: - Môi trường nuôi cấy: HA; - pH: 7;
- Tốc độ vòng: 200v/p;
- Nồng độ muối: từ thí nghiệm 1.
Yếu tố thí nghiệm: Mức nhiệt độ 32oC, 37oC, 42oC, 47oC;
Chỉ tiêu theo dõi: Đánh giá khả năng tăng sinh khối của vi khuẩn qua mật độ quang của tế bào ở bước sóng 620nm tại các thời điểm 0, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 (h).
Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của pH môi trường đến sinh trưởng của vi khuẩn
Yếu tố phi thí nghiệm: - Môi trường nuôi cấy: HA; - Nhiệt độ: từ thí nghiệm 2; - Tốc độ vòng: 200v/p;
- Nồng độ muối: từ thí nghiệm 1.
Yếu tố thí nghiệm: Mức pH 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5;
Chỉ tiêu theo dõi: Đánh giá khả năng tăng sinh khối của vi khuẩn qua mật độ quang của tế bào ở bước sóng 620nm tại các thời điểm 0, 24, 48, 72,