Đối tượng, vật liệu nghiên cứu - (LUẬN văn THẠC sĩ- 123docz.net

3.1.1. Đối tượng nghiên cứu

28 chủng vi khuẩn chịu mặn được phân lập từ chượp mắm tại Hải Phòng và Nam Định.

STT Tên chủng Địa điểm Loại cá Thời điểm chượp (tháng)

1 CH2.1 Hải Phòng Cá quẩn 2 2 CH3.3 3 3 CHN6.1 6 4 CT13.1 Nam Định Cá cơm 13 5 CT13.2 13 6 CT14.1 14 7 CT14.2 14 8 LT6.1 Cá lâm 6 9 LT6.3 6 10 LT8.2 8 11 LT9.2 9 12 Nh1.1 Cá nhâm 1 13 Nh1.2 1 14 Nh1.3 1 15 Nh3.1 3 16 Nh3.3 3 17 Nh5.2 5 18 Nh6.2 6 19 Nh6.5 6 20 TT12.2 Cá trích 12 21 TT8.1 8 22 TT8.5 8 23 TT8.6 8 24 TT8.6 8 25 TT9.1 9 26 TT9.2 9 27 TT9.3 9 28 TT9.6 9

3.1.2. Địa điểm, thời gian nghiên cứu

- Địa điểm thực hiện: Phòng thí nghiệm Trung tâm khoa học và Công nghệ thực phẩm, khoa Công nghệ thực phẩm – Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam.

- Thời gian thực hiện đề tài: 3/2019 – 10/2019.

3.1.3. Dụng cụ

- Dụng cụ: pipet các loại, pipet man 1ml, pipet man 0,1 ml; bình tam giác các loại, đĩa petri, ống nghiệm, giá để ống nghiệm, phễu chiết, bình định mức các loại, lam kính, ống fancol, ống eppendorf, bút viết kính, túi bóng kính, màng bọc thực phẩm, đèn cồn, que cấy chang, que cấy ria,…

3.1.4. Môi trường nuôi cấy

- Môi trường halophilic (HA): môi trường dinh dưỡng phân lập và nuôi cấy vi khuẩn chịu mặn (g/l): NaCl (250), cao nấm men (5), KCl (2), sodium glutamate (1), trisodium citrate (3), MgSO2.7H2O (20), FeCl3 (0.036), MnCl2.4H2O (0.00036), Agar (20), pH = 7.2 ± 0.2, hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút.

- Môi trường lỏng halophilic: thành phần như môi trường halophilic nhưng không có agar dùng để nuôi vi khuẩn.

3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Tuyển chọn chủng có khả năng phân giải histamine cao từ 28 chủng vi khuẩn chịu mặn được phân lập từ chượp mắm Hải Phòng và Nam Định;

- Định danh chủng vi khuẩn phân giải histamine cao đã tuyển chọn trên bằng sinh học phân tử;

- Ảnh hưởng của điều kiện đơn yếu tố và tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy của chủng vi khuẩn đã được tuyển chọn:

+ Ảnh hưởng điều kiện đơn yếu tố (pH, nhiệt độ, nồng độ muối) đến khả năng sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn;

+ Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy của chủng vi khuẩn theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm đa yếu tố.

3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1. Bố trí thí nghiệm 3.3.1. Bố trí thí nghiệm

Ảnh hưởng của các đơn yếu tố đến sinh trưởng của chủng vi khuẩn

Bố trí các thí nghiệm một nhân tố

Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ muối đến sinh trưởng của vi khuẩn

 Yếu tố phi thí nghiệm: - Môi trường nuôi cấy: HA; - pH: 7;

- Nhiệt độ: 37oC; - Tốc độ vòng: 200v/p.

 Yếu tố thí nghiệm: Mức nồng độ muối 2%; 5%; 8%; 12%; 15%;

 Chỉ tiêu theo dõi: Đánh giá khả năng tăng sinh khối của vi khuẩn qua mật độ quang của tế bào ở bước sóng 620nm tại các thời điểm 0, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 (h).

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sinh trưởng của vi khuẩn

 Yếu tố phi thí nghiệm: - Môi trường nuôi cấy: HA; - pH: 7;

- Tốc độ vòng: 200v/p;

- Nồng độ muối: từ thí nghiệm 1.

 Yếu tố thí nghiệm: Mức nhiệt độ 32oC, 37oC, 42oC, 47oC;

Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của pH môi trường đến sinh trưởng của vi khuẩn

 Yếu tố phi thí nghiệm: - Môi trường nuôi cấy: HA; - Nhiệt độ: từ thí nghiệm 2; - Tốc độ vòng: 200v/p;

- Nồng độ muối: từ thí nghiệm 1.

 Yếu tố thí nghiệm: Mức pH 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5;

Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để thu sinh khối dựa vào kết quả của 3 thí nghiệm trên

Thí nghiệm 4: Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để thu sinh khối

Yếu tố thí nghiệm trước mã hóa Yếu tố thí nghiệm sau mã hóa Mật độ tế bào vi khuẩn Công thức TN Nhiệt độ (0C) pH Nồng độ muối (%) Công thức TN X1 X2 X3 1 X1 Y1 Z2 1 -1 -1 0 2 X3 Y1 Z2 2 1 -1 0 3 X1 Y3 Z2 3 -1 1 0 4 X3 Y3 Z2 4 1 1 0 5 X1 Y2 Z1 5 -1 0 -1 6 X3 Y2 Z1 6 1 0 -1 7 X1 Y2 Z3 7 -1 0 1 8 X3 Y2 Z3 8 1 0 1 9 X2 Y1 Z1 9 0 -1 -1 10 X2 Y3 Z1 10 0 1 -1 11 X2 Y1 Z3 11 0 -1 1 12 X2 Y3 Z3 12 0 1 1 13 X2 Y2 Z2 13 0 0 0 14 X2 Y2 Z2 14 0 0 0 15 X2 Y2 Z2 15 0 0 0

Với mô hình thiết kế thí nghiệm Box-Behnken ở trên, thực hiện 15 thí nghiệm để lựa chọn điều kiện nuôi cấy tối ưu cho chủng để chủng phát triển thu được sinh khối lớn nhất bằng cách xác định mật độ quang của vi khuẩn sau các thời gian khác nhau.

3.3.2. Phương pháp phân tích

3.3.2.1. Tuyển chọn chủng có khả năng phân giải histamine

Phương pháp được tiến hành theo Tapingkae et al. (2010) và các bước tiến hành như sau:

Bổ sung 250µl dịch nuôi cấy của 28 các chủng vi khuẩn có khả năng chịu mặnđã được tuyển chọn vào 5ml môi trường HA lỏng tương ứng đã được hấp khử trùng và nuôi cấy trong tủ nuôi có lắc với tốc độ vòng 200 vòng/phút ở 37oC trong khoảng từ 3 – 4 ngày. Tiếp theo, lấy 250µl dịch nuôi cấy trước đó chuyển sang 5ml môi trường mới có bổ sung 5% histamine 5mM so với tổng thể tích và tiếp tục nuôi trong tủ nuôi lắc với các thông số không thay đổi trong vòng 7 ngày. Dịch nuôi cấy được li tâm thu dịch sau 4 ngày và 7 ngày xác định hàm lượng

histamine bị mất đi. Dịch ly tâm được sử dụng để đo hàm lượng histamine còn lại bằng phương pháp HPLC. Hoạt tính phân giải histamine của vi khuẩn được xác định bằng phần trăm histamine bị phân giải trong dịch ly tâm.

3.3.2.2. Định danh chủng vi khuẩn có khả năng phân giải histamine bằng phương pháp xác định trình tự gene 16S rRNA

Phương pháp được tiến hành theo Yi-Lin Chen et al. (2015) gồm 2 bước và được mô tả như sau:

- Tách chiết

DNA tổng số được tách chiết như sau: Sinh khối vi sinh vật được thu lại bằng cách ly tâm sau đó trộn trong 0,5 ml đệm (Tris-HCl, EDTA, NaCl, SDS). Ủ phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Bổ sung 0,15 ml CH3COOK. Ly tâm 10000 rpm, thu dịch trong, tủa DNA bằng isopropanol tỉ lệ 1:1, tiếp tục ly tâm ở 13000 vòng trong 10 phút ở 40C thu tủa. Rửa tủa bằng etanol 70%. Làm khô tủa, hòa tan lại DNA với 50μl H2O PCR

- Phản ứng PCR

Đoạn gen 16S rARN được khuếch đại bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi:

27F: 5' AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3'

1492R: 5' TACGGYTACCTTGTTACGACTT 3'

Với các chu trình nhiệt độ như sau: 94C trong 3 phút; 30 chu kỳ (94C trong 30 giây, 52C trong 30 giây và 72C trong 1 phút); 72C trong 10 phút và bảo quản ở 20C.

- Xác định trình tự gene và xác định loài: Sau khi tinh sạch, sản phẩm PCR được đọc trình tự trên hệ thống 3730xl DNA Analyzer (Thermo Scienctific, Mỹ) theo phương pháp Sanger. Trình tự gen 16S rARN được so sánh với các trình tự đã công bố sử dụng cơ sở dữ liệu của EzBioCloud.

3.3.2.3. Phân tích hàm lượng histamine bằng HPLC

Phân tích hàm lượng histamine được tiến hành theo phương pháp của Tahmouzi. S et al. (2011) có cải tiến.

a. Nguyên lí

Histamine có trong mẫu nước mắm được tách chiết bằng metanol. Dịch chiết được làm sạch trên cột trao đổi anion, sau đó được tạo dẫn xuất huỳnh

quang với OPA (phtha định bằng hệ thống HP chuẩn. Dung dịch chiế sắc khí với detector hu b. Chương trình chạy - Cột sắc ký - Nhiệt độ cột - Pha động Axetonnitrin 100% - Tốc độ dòng - Bước sóng kích thí - Bước sóng phát x - Thể tích tiêm : 5 Hì Hình 0 500 1000 1500 2000 2500 0 D iệ n t íc h

(phthaldialdehyde). Hàm lượng dẫn xuất hista ng HPLC với detector huỳnh quang theo phư

ết được dẫn xuất hoá sau đó được bơm vào or huỳnh quang bước sóng sử dụng là Ex 230nm

: cột C18 (5µm, 4.6 × 250mm) : 40oC : Hỗn hợp gồm CH3COONH4 0,02M, 100%, pH=3 : 1 ml/min ích thích: 230 nm hát xạ : 450nm : 5 µl Hình 3.1. Sắc kí đồ chuẩn histamine

Hình 3.2. Đồ thị đường chuẩn histamine

y = 2195.x - 46 R² = 0.998 0.2 0.4 0.6 0.8 Nồng độ (mM) t histamine được xác o phương pháp ngoại m vào cột HPLC chạy 230nm và 450nm. ,02M, pH=5; 46.27 .998 1 1.2

3.3.2.4. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy bằng mô hình Box-Behnken

Để tối ưu hóa khả năng sinh trưởng tốt nhất của chủng có khả năng phân giải histamine được tuyển chọn theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm nhiều yếu tố, sử dụng kết quả khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đơn lẻ (kết qủa của thí nghiệm trước). Trong bài toán tốt ưu, các yếu tố được khảo sát đồng thời ở các khoảng biến thiên nhất định, gồm: pH môi trường, nhiệt độ nuôi cấy, nồng độ muối. Hàm mục tiêu là khả năng sinh trưởng của chủng tuyển chọn trong quá trình nuôi cấy. Ma trận thực nghiệm được bố trí theo Box-Behnken.

Với mô hình thiết kế thí nghiệm Box-Behnken ở trên, thực hiện 15 thí nghiệm để lựa chọn điều kiện nuôi cấy tối ưu cho chủng nhằm thu được sinh khối lớn nhất.

Để xác định miền tối ưu cho ba yếu tố thí nghiệm, kết quả phân tích mật độ quang (Abs620nm) tại mỗi thời điểm nuôi cấy được khớp với phương trình đa thức bậc 2 (phương trình 1) bao gồm phần tuyến tính bậc 1, bậc 2, tương tác 2 yếu tố bậc 1 bằng phương pháp hồi quy đa biến.

2 0 1 1 1 X k k k i i ii i ij i j i i i j Y   X   X X            

Trong đó Y là biến số đầu ra, βo, βi βii, βij là các hệ số hồi quy, Xi là các biến số độc lập, k là số các biến số đầu vào và Ɛ là sai số. Hệ số tương quan được ước lượng nhờ phương pháp bình phương tối thiểu. Tầm quan trọng của mô hình tổng thể và của từng hệ số hồi quy được đánh giá bằng phân tích phương sai (ANOVA). Cuối cùng, kỹ thuật tối ưu hóa đa biến dựa trên hàm kỳ vọng Derringer được sử dụng (Derringer and Suich, 1980; Bezerra et al., 2008). Hàm kỳ vọng này biến đổi giá trị đầu ra (OD) thành điểm mong muốn (d), dao động từ 0 (hoàn toàn không mong muốn) đến 1 (hoàn toàn mong muốn). Hàm kỳ vọng có nhiều dạng phụ thuộc vào tiêu chí tối ưu hóa: tối thiểu, tối đa, hay phù hợp với tiêu chuẩn nhất định. Hàm kỳ vọng có dạng như phương trình 2.

,min , ,min 0 ( ) ( 1 i wi i i i i max i i d y y d y y d              ,min ,min ,max ,max i i i i i i y y y yi y y y     , (2) (1)

Trong đó yi, min and yi, max là mức mong muốn tối đa hoặc tối thiểu của mỗi biến số đầu ra i, tương ứng với giá trị Abs mong muốn chúng tối đa hay tối thiểu. (wi) là hệ số trọng lượng. Giá trị đầu ra Abs mong muốn là tối đa. Việc tối ưu hóa đa biến được thực hiện nhờ phần mềm JMP, phiên bản 13.0 (SAS Institute, Inc., Cary, NC, USA).

3.3.2.5. Phương pháp xác định một số đặc điểm của chủng vi khuẩn

- Xác định đặc điểm hình thái khuẩn lạc

Chuẩn bị 5 ml môi trường HA trong ống fancol, hấp tiệt trùng ở 121oC, 15 phút, sau đó dùng que cấy lấy khuẩn lạc trên đĩa đã được ria thuần cho vào môi trường đã chuẩn bị, nuôi cấy chủng vi khuẩn trong 4 ngày ở tủ nuôi lắc 200 vòng/phút, 37oC.

Pha loãng dịch nuôi cấy rồi tiến hành trang đều trên mặt đĩa thạch đã chuẩn bị, tiến hành với 2 đĩa.

Đặt vào tủ nuôi 37oC sau 4 ngày đem ra quan sát hình thái khuẩn lạc - Xác định khả năng di động

Phương pháp xác định khả năng di dộng được mô tả theo Nguyễn Lân Dũng và cs., 2006:

Cơ chế: một số vi khuẩn có tiêm mao (lagella) nên có khả năng di dộng

trong môi trường bán lỏng và làm đục môi trường hay mọc giống như rễ cây xung quanh đường cấy.

Môi trường: HA bán lỏng, để đứng

Thao tác:

Dùng que cấy thẳng lấy khuẩn lạc trong đĩa thạch HA đã ria thuần chuyển sang ống nghiệm thạch bán lỏng, trích thẳng từ trên xuống dưới ngay giữa ống môi trường. Sau đó nuôi ở 37oC, trong vòng 24-48 giờ.

Kết quả:

Vi khuẩn phản ứng di động dương (+): vi khuẩn mọc lan ra khỏi đường cấy, xa hay gần tùy theo khả năng di động của vi khuẩn mạnh hay yếu.

Phản ứng di động âm (-): vi khuẩn chỉ mọc trên đường cấy. - Xác định hoạt tính catalase

Mục đích: kiểm tra khả năng phân hủy H2O2 tạo ra O2 của vi sinh vật nhờ sản sinh ra enzyme catalase.

Phương pháp thử nghiệm catalase được tiến hành theo mô tả bởi Nguyễn Đức Lượng và Cao Cường, 2003 như sau;

Cơ chế: enzyme catalase thường gặp ở vi khuẩn hiếu khí hay kỵ khí tùy

tiện. Catalase có khả năng phân giải peroxide tạo O2 và nước. Vi khuẩn

H2O2 Enzyme catalase H2O + [O2]

Thao tác: Dùng que cấy vòng, lấy đầy 1 vòng cấy vi khuẩn hòa vào giọt

H2O2 quan sát.

Phản ứng Catalase âm tính: Giọt H2O2 không sủi bọt. Phản ứng Catalase dương tính: Giọt H2O2 sủi bọt. - Nhuộm Gram và quan sát hình thái tế bào

Cơ chế: Vi khuẩn Gram dương có thành tế bào dày, có khả năng giữ phức

hợp tím tinh thể iot, trong khi đó lớp thành tế bào của vi khuẩn Gram âm thì mỏng, sau khi nhuộm với phức hợp tím và qua các bước khử màu. Vi khuẩn Gram âm có thành tế mỏng, không thể giữ lại phức hợp tím tinh thể iot bên trong tế bào vì vậy chúng bị khử màu. Ngược lại, đối với vi khuẩn Gram dương, thành tế bào dày nên giữ lại được phức hợp tím tinh thể-iot.

Quy trình nhuộm gồm các bước sau:

+ Bước 1: làm tiêu bản vết bôi vi sinh vật bằng cách nhỏ một giọt nước cất hoặc nước muối sinh lí lên lam kính, dùng que cấy đã vô trùng hơ trên ngọn lửa đèn cồn đến khi nóng đỏ và để nguội. Khi que cấy nguội, lấy một ít vi sinh vật hoà vào giọt nước cất hoặc nước muối sinh lí.

+ Bước 2: cố định vết bôi, thường cố định bằng cách hơ nhẹ trên ngọn đèn cồn, đưa vết bôi qua nhanh ngọn lửa đèn cồn 2 – 3 lần. Tránh hơ nóng quá sẽ làm biến dạng hình thái và cấu trúc của tế bào vi sinh vật.

+ Bước 3: Nhuộm tiêu bản bằng tím tinh thểhay tím gentian,nhuộm mẫu trong 1phút, dùng pipet nhỏ lên vết bôi một giọt thuốc nhuộm, giữ trong 1 – 2 phút rồi rửa nước.

+ Bước 4: Nhuộm bằng dung dịch lugol và giữ trong 1 phút sau đó rửa lại với nước.

+ Bước 5: Khử màu, nhỏ dung dịch alcohol 90%, giữ khoảng 30 giây sau đó rửa lại với nước.

+ Bước 6: Nhuộm bằng dung dịch Fucshin trong 1 phút, rửa nước và để khô + Bước 7: quan sát tiêu bản ở vật kính dầu 100x, khởi động và kiểm tra kính hiển vi. Trước khi đặt tiêu bản lên giá kính, ta nhỏ một giọt dầu lên vị trí nhuộm sau đó đặt lên giá kính. Chỉnh vị trí quan sát vào trung tâm của quang trường ở bội giác x100 và chọn cường độ ánh sáng phù hợp. Sử dụng vi chỉnh để điều chỉnh độ nét phù hợp với mắt của người quan sát.

Chỉ tiêu quan sát: hình dạng, cách sắp xếp của tế bào vi khuẩn, có hay không có bào tử,...