2.3.4.1. Trên thế giới
Nghiên cứu β-galactosidase từ nấm men được nghiên cứu khá đầy đủ và sản phẩm β-galactosidase thương mại hiện nay chủ yếu là sản xuất từ nấm men. Các loài nấm men như Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Torulopsisspherical, Torulautilis sp, Sacchromyces fragilis, Candida pseudotropicalis. β-galactosidase từ Sacchromyces fragilis được nghiên cứu từ
rất sớm. Về lactase của Candida pseudotropicalis, nghiên cứu của Sonia A et al (1979), nuôi trong canh trường chứa 10-12% nước chiết rút sản xuất phomai (whey) bổ sung thêm khoáng và nước chiết nấm men. Hoạt tính enzyme thu được là 468 U/ml và 4.35 U/g sinh khối. Hoạt tính enzyme tối ưu ở pH 6.2 và nhiệt độ 47oC. Hoạt tính này có thể bảo tồn 95% sau 3 tháng bảo quản ở -20oC. Trên thế giới việc tạo dòng và nghiên cứu sản xuất β-galactosidase đã được thực hiện từ lâu. Gần đây, có một vài công trình tiêu biểu như Petzelbauer et al., 2000;
Hanson and Adlercreutz, 2001; Park et al., 2008… đều cho thấy nguồn gene mã hóa β-galactosidase đã được phân lập từ các nguồn vi khuẩn khác nhau, được tạo dòng và biểu hiện trong E. coli. Một số công trình công bố về tạo dòng và biểu
hiện β-galactosidase từ LactoBacillus reuteri 103X và Bacillus megaterium (Li et
al., 2005) đã nhân dòng, biểu hiện, tinh sạch và xác định đặc tính của β-
galactosidase (Aaβ-gal) từ vi khuẩn vừa có khả năng chịu nhiệt vừa có khả năng chịu acid AlicycloBacillus acidocaldarius. Nhóm của Nguyễn Thu Hà và cs,
2006 nghiên cứu sự biểu hiện của β-galactosidase ở 2 chủng LactoBacillus reuteri L103 và L461. Đây là nghiên cứu hoàn toàn cơ bản, cho thấy 2 enzyme
bao gồm 2 tiểu phần (2 chuỗi peptide có trọng lượng là 35kDa và 75kDa). Các enzyme này có khoảng pH hoạt động khá hẹp, một enzyme từ pH 3.8 – 4.0 (chủng L461) và một pH 4.6 – 4.8 (chủng L103). Nhóm tác giả này sau đó có một số nghiên cứu tinh sạch enzyme để sử dụng tổng hợp galacto - oligosaccharides mang hoạt độ sinh học.
2.3.4.2. Tại Việt Nam
từ Aspergillus oryzae và xác định một số tính chất lý - hóa của nó. Quyền Đình Thi và cs. (2008) đã tạo dòng và phân tích trình tự gene mã hóa β-galactosidase từ chủng Bacillus subtilis G1. Ngoài ra có công trình nghiên cứu của Trương Nam Hải (2004) với đề tài cấp quốc gia “Nghiên cứu, phân lập và tạo chủng giống bằng kỹ thuật di truyền để sinh tổng hợp β-galactosidase có hiệu suất cao và ứng dụng trong thực phẩm” đã thành công trong biểu hiện và xác đi ̣nh hoạt độ β-galactosidase nhưng việc biểu hiện trong E. Coli lại không an toàn trong thực phẩm, protein thu được đa phần nằm trong dạng thể vùi dẫn đến gặp khó khăn trong việc thu hồi enzyme có hoạt độ cao ứng dụng trong quy mô công nghiệp. Gần đây có một số nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Vân Linh và cs. (2013) đã nghiên cứu thu nhận và tinh sạch β-galactosidase từ LactoBacillus acidophilus.
Và tác giả Nguyễn Hoàng Anh và Trần Thị Na (2017) nghiên cứu tuyển chọn và định danh vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh β-galactosidase chịu nhiệt.
Từ thực trạng nghiên cứu cho thấy ở Việt Nam những nghiên cứu về β- galactosidase mới dừng lại ở nghiên cứu cơ bản, có một số nghiên cứu ứng dụng tạo GOS để bổ sung và sản xuất các sản phẩm: sữa chua, thực phẩm chức năng và vi sinh vật chịu nhiệt. Tuy nhiên trong nước chưa có nghiên cứu nào liên quan tới việc tuyển chọn các vi sinh vật sinh enzyme chịu lạnh.
Kế thừa những thành quả đạt được chúng tôi đưa ra mục tiêu sẽ tuyển chọn và định tên được các chủng lactic/Bacillus có khả năng tạo β-galactosidase chịu lạnh, một trong những đối tượng được chú trọng nghiên cứu từ lâu do ưu điểm nổi bật là khả năng an toàn (“genereally regarded as safe”- GRAS) được Hiệp hội Thuốc và Thực phẩm của Mỹ FDA chứng nhận và khả năng chịu được các điều kiện nuôi cấy, bảo quản khắc nghiệt (Driks, 1999). Từ enzyme thu nhận được chúng tôi sẽ xác định ảnh hưởng của nhiê ̣t đô ̣ thấp tới enzyme, sau đó đưa đi xác định khả năng phân giải lactose trong sữa tươi ở nhiệt độ thấp để ứng dụng trong viê ̣c sản xuất sữa tươi tiệt trùng không lactose. Đây là hướng mới của đề tài so với các nghiên cứu trên.
PHẦN 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. VẬT LIỆU
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Từ các nghiên cứu khảo sát trước đây, 68 chủng vi khuẩn (lactic và
Bacillus) đã được phân lập từ sữa tươi, sữa chua và các nguồn đất khác nhau đã
được định danh sơ bộ bằng hình thái và phương pháp hóa sinh, lưu giữ tại ngân hàng giống của phòng Thí nghiệm Trung tâm, khoa Công nghệ thực phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam (bảng 3.1) được sử dụng để sàng lọc vi khuẩn có khả năng sinh β-galactosidase ưa lạnh.
Bảng 3.1. Các chủng vi khuẩn được sử dụng để nghiên cứu
STT Nguồn phân lập Số chủng Tên kí hiệu các chủng
1 Mẫu sữa
1.1 Sữa bò tươi tại trại bò Đông Anh 4 SDA2, SDA3, SDA3.1, SDA4 1.2 Sữa bò tươi tại trại bò Phù Đổng 7 SPD1.3, SPD1.7, SPD2.3, SPD2.5, SPD2.7, SPD3.3,
SPD3.7
1.3 Sữa chua Vinamilk 3 SC3, SC4, SC5
1.4 Sữa bò trong kho lạnh tại trại bò Ba Vì 2 SBV3, SBV4
2 Mẫu phomai 2.1 Mẫu phomai Helio 2 PM3, PM5
3 Mẫu đất
3.1
Mẫu đất vườn khu dân cư và mẫu đất trồng cỏ bò sữa
Mộc Châu 6
DA15.1, DA15.3, BA15.1, BA15.2, BA15.3, BA15.6 3.2 Đất hố và đất trại bò sữa Mộc Châu 6 BA23.1, BA23.2, BA23.3, BA23.4, BA23.5, BA23.7 3.3 Đất ven trại bò và đất chuồng bò Mộc Châu 4 BA46.1, BA46.2, BA46.3, DA46.3 3.4 Đất xung quanh chuồng bò sữa ở Ba Vì 4 BBV3, BBV4, BBV5, BBV6 3.5
Đất xung quanh ống nước thải từ chuồng bò sữa Phù
Đổng 9
NT4.1, NT4.2, NT4.3, NT4.4, NT4.5, NT4.6, NT4.7, NT4.8, NT4.9
3.6 Mẫu lấy trong nền kho sữa lạnh ở Ba Vì 4 KL3, KL4, KL5, KL7
4 Mẫu phân
4.1 Phân bò sữa ở Nghệ An 7
PBNA1, PBNA2, PBNA3, PBNA4, PBNA5, PBNA7, PBNA9 4.2 Phân bò sữa ở Phù Đổng 10 PB3.1, PB3.2, PB3.3, PB3.4, PB3.5, PB3.6, PB3.8, PB3.9, PB3.10, PB3.11 Tổng = 68 chủng
3.1.2. Môi trường nuôi cấy, thí nghiệm
Môi trường MRS và NA được dùng để hoạt hóa vi khuẩn lactic và Bacillus.
Bảng 3.2. Môi trường đĩa thạch MRS pH: 6-6,5 sử dụng lactose
Thành phần g/Lít Lactose 20,0 K2HPO4 2,0 CH3COONa 5,0 Cao thịt 10,0 Triamoni xitrat 2,0 Pepton 10,0 MgSO4.7H2O 0,58 Cao nấm men 5,0 MnSO4.4H2O 0,28 Tween 80 1ml Agar 15
Môi trường MRS lỏng dùng để hoạt hóa vi khuẩn lactic có thành phần giống với môi trường MRS thạch nhưng không bổ sung agar.
Bảng 3.3. Môi trường đĩa thạch NA (Mirac Yilmaz et al., 2006) Thành phần Nồng độ (g/l) Pepton 10g NaCl 5g Cao thịt 5g Agar 20g Nước cất 1 lít
Môi trường NB (Mirac Yilmaz et al., 2006) dùng để hoạt hóa vi khuẩn Bacillus có thành phần giống môi trường NA nhưng không sử dụng agar.
3.1.3. Thiết bị và dụng cụ
3.1.3.1. Thiết bị
Bảng 3.4. Danh sách các thiết bị sử dụng để nghiên cứu STT Tên thiết bị Hãng sản xuất Xuất xứ
1 Tủ lạnh Toshiba Nhật
2 Máy phá vỡ tế bào Manton-Gaulin Đức
3 Máy ly tâm Rotor 6 chỗ Hettich Đức
4 Máy ly tâm lạnh Rotor 24 chỗ Hettich Đức
5 Quang phổ tử ngoại khả kiến UV-VIS Shimadzu Nhật
6 Máy Vortex Thermomixer Mỹ
7 Cân phân tích điện tử Ohaus Trung Quốc
8 Cân kỹ thuật điện tử Ohaus Trung Quốc
9 Tủ sấy Memmert Đức
10 Nồi hấp tiệt trùng ALP Nhật
11 Máy đo pH để bàn Thermo Mỹ
12 Tủ ấm lạnh có lắc JS Hàn Quốc
13 Bể siêu âm Elma Đức
14 Máy lắc ổn nhiệt Thermomixer Mỹ
15 Máy khuấy từ gia nhiệt IKA Trung Quốc
16 Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC với
đầu dò RID Shimadzu Nhật
17 Máy lọc nước khử ion Thermomixer Mỹ
3.1.3.2. Dụng cụ
Các dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu bao gồm các dụng cụ cơ bản như: cốc đong, pipet thủy tinh, bình đựng, que cấy, que trang, ống nghiệm, ống fancol (15 ml, 50 ml), đĩa peptri, bình tam giác (50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml) bình định mức (50 ml, 100 ml, 200 ml, 250 ml), ống đong, cốc thủy tinh, đũa thủy tinh, đèn cồn, màng lọc, micropipet…
3.1.3.2. Hóa chất
Bảng 3.5. Danh sách các hóa chất
STT Tên hóa chất Xuất xứ
1 HCl Trung Quốc
2 KH2PO4 Trung Quốc
3 MgSO4 Trung Quốc
4 NaCl Đức 5 Glucose Đức 6 Galactose Đức 7 Lactose Đức 8 Acetonitrile Đức 9 X- gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranosit) Đức 10 oNPG (ortho-Nitrophenyl-β-galactoside) Đức 11 NaH2PO4. 2H2O Đức
12 TCA (Trichloroacetic acid) Ấn Độ
13 Etanol Việt Nam
14 SDS Đức
15 CH3COOK Trung Quốc
16 Na2CO3 Đức
17 IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) Đức
18 NaOH Trung Quốc
19 Lugol Trung Quốc
20 Fuchsin Trung Quốc
21 Glyxerol Trung Quốc
22 EDTA Đức
23 (NH4)2SO4 Trung Quốc
24 Ca(COOH)2 Đức
25 Tris-HCl Đức
26 Isopropanol Đức
27 BSA (Bovine serum albumin) Trung Quốc
28 Coomassie Brilliant Blue Đức
3.2. ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Đi ̣a điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm trung tâm Khoa học và công nghệ thực phẩm, khoa Công nghệ Thực phẩm - Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Tuyển chọn vi khuẩn sinh β-galactosidase.
- Xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp β-galactosidase.
- Tuyển chọn vi khuẩn sinh β-galactosidase có hoạt độ cao ở nhiệt độ thấp.
- Tinh sạch sơ bộ β-galactosidase.
- Xác định đặc tính của enzyme sau khi tinh sạch sơ bộ.
- Định tên vi khuẩn có khả năng sinh β-galactosidase ưa lạnh.
- Bước đầu đề xuất quy trình sản xuất sữa tươi tiệt trùng không lactose sử dụng β-galactosidase ưa lạnh.
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1. Tuyển chọn vi khuẩnsinh β-galactosidase
3.4.1.1. Phương pháp hoạt hóa và nuôi cấy giống
Phương pháp hoạt hóa và nuôi cấy giống được tiến hành theo Nguyễn Lân Dũng và cs. (1978) và được mô tả như sau:
- Hoạt hóa lần 1
•Chuẩn bị các ống nghiệm có chứa 5ml môi trường NB (cho vi khuẩn
Bacillus) hoặc môi trường MRS lỏng (cho vi khuẩn lactic) đã hấp khử trùng ở
121oC, 1 atm, trong 15 phút. Dùng đầu que cấy nhọn tiệt trùng lấy khuẩn lạc và cho vào ống nghiệm. Nút miệng ống nghiệm bằng màng bọc thực phẩm, đánh dấu tên chủng, thời gian cấy. Các thao tác thí nghiệm đều được thực hiện trong buồng cấy vi sinh và trên ngọn lửa đèn cồn. Sau đó, các ống nghiệm được chuyển vào tủ nuôi cấy, nuôi ở 37oC, lắc 200 vòng/phút trong vòng 24 giờ.
- Hoạt hóa lần 2
•Tiếp giống 1% từ ống nghiệm hoạt hóa vào bình tam giác chứa môi trường NB (Bacillus) hoặc MRS lỏng (lactic) có bổ sung 1% đường lactose đã hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Nuôi cấy ở 37oC, lắc 200 vòng/phút trong 24h.
3.4.1.2. Xác định vi khuẩn sinh β-galactosidase bằng phương pháp Test X-Gal
Chủng vi khuẩn Bacillus/lactic sinh β-galactosidase được xác định theo
sau: β-galactosidase thuỷ phân X-gal hình thành sản phẩm kết tủa màu xanh da trời kiểu indigo. Vì vậy, vi khuẩn dương tính với β-galactosidase sẽ tạo khuẩn lạc màu xanh khi nuôi cấy trên môi trường đĩa thạch bổ sung chỉ thị X-gal và lactose.
- Xác định khả năng sinh enzyme β–galactosidase bằng phương pháp cấy chấm điểm trên đĩa thạch.
+ Môi trường NA bổ sung 1% đường lactose (dùng cho vi khuẩn Bacillus) và môi trường MRS có sử dụng 1% đường lactose (dùng cho vi
khuẩn lactic) được hấp vô trùng và làm nguội, sau đó bổ sung 60 µl X-gal nồng độ 20 mg/ml và 10 µl IPTG 0,1M trên mỗi đĩa, chang đều.
+ Tiến hành cấy chấm điểm chủng vi khuẩn trên mỗi đĩa bằng dịch hoạt hóa.
+ Đĩa cấy vi sinh vật được đưa vào tủ nuôi cấy ở nhiệt độ 37oC, trong điều kiện tối. Kiểm tra kết quả sau 24h, 48h.
3.4.1.3.Phương pháp xác định hoạt độ của β-galactosidase của vi khuẩn
Các bước xác định hoạt độ enzyme ngoại bào và nội bào của vi khuẩn được thực hiện như sau:
• Từ dịch lên men của chủng vi khuẩn sau 24h được đem đi ly tâm (6000 vòng trong 10 phút ở 4ºC) trong môi trường MRS hoặc NA chứa lactose 1%. Tách phần dịch trong sau ly tâm để đem đi xác định hoạt độ ngoại bào.
• Sinh khối còn lại sau ly tâm được pha loãng bằng đệm phosphate pH 6.5. Phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm trong 5 phút với cường độ dao động 70% và tần suất 10 giây on - 15 giây off. Dịch đã phá vỡ tế bào được đem đi ly tâm 6000 vòng trong 10 phút ở 4oC thu phần dịch trong để xác định hoạt độ nội bào.
Hoạt độ của β-galactosidase nội bào và ngoại bào được xác định cho các dịch enzyme tương ứng theo phương pháp của Nguyễn Thu Hà và cs. 2006, được mô tả như sau: Hoạt độ β-galactosidase được xác định bằng cách cho enzyme này phản ứng với cơ chất tổng hợp ortho-nitrophenyl-β -galactopyranoside (oNPG). Dưới tác dụng của β-galactosidase, oNPG sẽ thủy phân thành galactose và o-nitrophenol. O-nitrophenol khi giải phóng sẽ chuyển hỗn hợp phản ứng sang màu vàng và hấp thụ (Abs) ở bước sóng cực đại 420 nm.
Các dung dịch 1 2 3 4 5 6 Vdung dịch gốc (2 mM) (ml) 0 1 2 3 4 5
Vdung dịch đệm (ml) 5 4 3 2 1 0
Nồng độ (mM) 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
- Dùng 0.5ml oNP và 0.75ml Na2CO3 đo ở bước sóng 420nm, dựa vào sự tương quan giữa nồng độ oNP và giá trị Abs ở bước sóng 420nm xác định được tốc độ phản ứng của oNP qua đường chuẩn dựng bằng phần mềm Microsoft Excel.
Hình 3.1. Biểu đồ đường chuẩn oNP
Bước 2: Xác định hoạt độ của enzyme
+ Hút 480 µl oNPG vào ống eppendorf 1,5 ml, sau đó ống eppendorf được cho vào máy ổn nhiệt (thermomixer) ở 30oC, chờ 5 phút để nhiệt độ trong ống eppendorf đạt 30ºC trước khi đưa enzyme vào.
+ Bắt đầu phản ứng bằng cách thêm 20 µl dung dịch enzyme ngoại bào hoặc nội bào sau đó lắc đều ở 600 vòng/phút trong 10 phút.
+ Dừng phản ứng enzyme bằng cách bổ sung 750 µl Na2CO3 0.4 M vào trong ống eppendorf.
+ Đo độ hấp quang trên máy so màu ở bước sóng 420 nm.
Mẫu đối chứng được tiến hành tương tự như mẫu thí nghiệm, trong đó 20 µl dung dịch enzyme được thay thế bằng 20 µl dung dịch đệm phosphate pH 6.5.
Thí nghiệm lặp lại 3 lần, sai số ở 3 thí nghiệm không được vượt quá 5%.
y = 1,403x - 0,0048 R² = 0,9994 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 A b s Nồng độ (mM)
Tính kết quả:
Hoạt độ enzyme có trong 1 ml dịch nuôi cấy theo công thức sau:
= − × !
" # " $ × %& '(&./01 . + &*+,-2 × #Độ 567 *ã/9 :ủ7 ./01 .$
Trong đó:
U/ml: Hoạt độ β- galactosidase
Abs420nm: Độ hấp thụ quang của phản ứng màu đo được tại 420 nm Blank: Độ hấp thụ quang của mẫu đối chứng
SlopeoNPstandardcurve: Hệ số góc của đường chuẩn oNP
treaction: Thời gian phản ứng enzyme cơ chất (phút)
1U Lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa 1 μmol cơ chất trong một phút ở điều kiện phân tích xác định Số liệu được xử lý dựa vào đường chuẩn và bằng phần mềm Microsoft Excel.
3.4.2. Phương pháp xác định ảnh hưởng của thời gıan nuôi cấy đến sự sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp β-galactosidase trưởng và khả năng sinh tổng hợp β-galactosidase
Để xác định thời điểm nuôi cấy và thu nhận enzyme mà tại đó hoạt độ enzyme của vi khuẩn là cao nhất được tiến hành như sau: các vi khuẩn được tiến hành nuôi lỏng ở nhiệt độ 37 ºC sau 3h lấy mẫu một lần tại các thời điểm 6 giờ, 9 giờ, 12 giờ... đến 30 giờ, để đo mật độ quang tại 600nm và phá vỡ tế bào xác định hoạt độ. Hoạt độ tại các thời điểm được so sánh với nhau để xác định thời điểm sinh enzyme có hoạt độ cao nhất.
3.4.3. Phương pháp tuyển chọn vi khuẩn sinh enzyme có hoạt độ cao ở nhiệt độ thấp độ thấp
Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh enzyme có hoạt độ cao ở nhiệt độ thấp được xác định theo phương pháp của Nguyễn Thị Vân Linh và cs.,