3.4.5.1. Phương pháp xác định độ bền ở nhiệt độ thấp của β-galactosidase
Độ bền ở nhiệt độ thấp của β-galactosidase trong pH 6,5 được xác định theo phương pháp của Nguyễn Thị Vân Linh và cs., 2013. Để xác định đô ̣ bền ở nhiê ̣t đô ̣ thấp của enzyme, các enzyme này được ủ ở nhiệt độ 4oC trong pH 6,5. Tại các thời gian ủ khác nhau (1 giờ, 2 giờ, 8 giờ... đến 512 giờ), enzyme được lấy ra để xác định hoạt độ còn lại của enzyme theo phương pháp được mô tả ở mục 3.4.1.3. Độ bền ở nhiệt độ thấp của enzyme được xác định bằng cách so sánh % hoạt độ của enzyme tại thời điểm lấy ra xác định hoạt độ với thời điểm bắt đầu ủ.
3.4.5.2. Phương pháp xác định khả năng phân giải lactose trong sữa tươi của β-galactosidase ở nhiệt độ thấp
Xác định hàm lượng đường lactose phân giải trong sữa tươi nguyên liệu bằng hệ thống HPLC. Bao gồm đầu dò RID và một cột Carbonhydrat C18 (250 x 4 mm, 5 µm; Agilent), với chế độ chạy đẳng dòng sử dụng acetonitrile và nước khử ion (80 v/v) như pha động ở tốc độ dòng chảy 1 ml/phút.
Bước 1: Chuẩn bị chất chuẩn:
Dung dịch chuẩn stock lactose pha từ chuẩn lactose 99,5% xuất xứ từ Đức tại nồng độ 5% pha trong nước khử ion. Các chuẩn làm việc pha từ chuẩn trung gian xuống các nồng độ (0,3125 – 5%). Tất cả các chuẩn được pha mỗi ngày trước khi phân tích.
Bảng 3.7. Số liệu dựng đường chuẩn lactose
Dung dịch 1 2 3 4 5
Nồng độ 5% 2,5% 1,25% 0,625% 0,3125%
Diện tích
Hình 3.3. Biểu đồ đường chuẩn lactose
Bước 2: Chuẩn bị mẫu:
+ Các mẫu thí nghiệm đánh giá khả năng thuỷ phân lactose trong sữa được bố trí bằng hoạt tính enzyme so với lượng lactose như sau: CT1 (1,487 U/1g lactose), CT2 (2,110 U/1 g lactose), CT3 (2,812 U/1g lactose).
+ Mẫu được ủ ở 4oC sau mỗi mốc thời gian 6h, 9h, 12h, 15h, 18h, 21h, 24h, 27h lấy mẫu vào ống eppendorf 2ml đem đun sôi 10 phút để bất hoạt enzyme rồi ly tâm tại 6000 vòng trong 15 phút thu lấy 1ml dịch. Protein trong sữa được kết tủa bằng TCA 10%. Với mỗi 1ml dịch ở trên bổ sung thêm 100µl TCA. Tiếp tục ly tâm ở 6000 vòng trong 15 phút thu dịch. Lọc dịch bằng màng lọc 0,25 µm. Dịch thu được sau lọc cho vào ống Eppendorf sạch chuẩn bị đo hàm lượng lactose trên hệ thống HPLC.
Bước 3 : Chạy HPLC.
Tiêm 20 µL của mỗi mẫu cho phân tích HPLC. Đầu dò RID với một cột Carbonhydrat C18 (250 x 4 mm, 5 µm; Agilent). Các dung môi sử dụng là nước khử ion (dung môi A) và acetonitrile (dung môi B) với tốc độ dòng chảy 1 ml/phút. Rửa giải được chọn chế độ chạy đẳng dòng, hỗn hợp pha động là acetonitrile và nước khử ion (80 v/v).
Bước 4: Xử lý số liệu: Xử lý thống kê bằng Microsoft excel.