sử dụng enzyme β-galactose ưa lạnh
Từ các kết quả thu được về enzyme β-galactose ưa lạnh đã tuyển chọn cần tiến hành xem xét khả năng phân giải lactose trong sữa tươi ở nhiệt độ thấp. Từ đó đề xuất ứng dụng cho phù hợp.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. TUYỂN CHỌN VI KHUẨN SINH β -GALACTOSIDASE
4.1.1. Kết quả xác định vi khuẩn sinh β-galactosidase bằng phương pháp Test X-Gal Test X-Gal
Trong nghiên cứu này, việc xác định vi khuẩn sinh β-galactosidase được thực hiện theo phương pháp mô tả ở mục 3.4.1.1 và 3.4.1.2. Các khuẩn lạc xuất hiện màu xanh indigo là các chủng vi sinh vật có khả năng sinh β-galactosidase (hình 4.1) và kết quả sàng lọc các chủng vi khuẩn sinh β-galactosidase được trình bày ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Khả năng sinh enzyme bằng phương pháp test X-Gal STT Nguồn phân lập Chủng có hoạt tính
1 Mẫu
sữa
1.1 Sữa bò tươi tại trại bò Đông Anh SDA3 1.2 Sữa bò tươi tại trại bò Phù Đổng SPD2.3, SPD3.3
1.3 Sữa chua Vinamilk SC3, SC4, SC5
1.4 Sữa bò trong kho lạnh tại trại bò
Ba Vì -
2 Mẫu
Phomai 2.1 Mẫu phomai Helio -
3 Mẫu
đất
3.1 Mẫu đất vườn khu dân cư và mẫu
đất trồng cỏ bò sữa Mộc Châu BA15.6
3.2 Đất hố và đất trại bò sữa Mộc
Châu BA23.5
3.3 Đất ven trại bò và đất chuồng bò
Mộc Châu -
3.4 Đất xung quanh chuồng bò sữa ở
Ba Vì -
3.5 Đất xung quanh ống nước thải từ
chuồng bò sữa Phù Đổng NT4.1
3.6 Mẫu lấy trong nền kho sữa lạnh ở
Ba Vì KL3 4 Mẫu phân 4.1 Phân bò sữa ở Nghệ An - 4.2 Phân bò sữa ở Phù Đổng PB3.4 Tổng 11
Từ 68 chủng vi khuẩn sau khi kiểm tra bằng phương pháp cấy trên đĩa thạch sàng lọc được 11 chủng sinh β-galactosidase thủy phân X-gal tạo thành các khuẩn lạc có màu xanh. Các chủng này được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
4.1.2. Hoạt độ β-galactosidase của vi khuẩn
Các chủng đã được tuyển chọn (ở bảng 4.1) được sử dụng để xác định hoạt độ của enzyme theo phương pháp như mô tả ở mục 3.4.1.3. Kết quả hoạt độ của enzyme được thể hiện ở hình 4.2.
Hình 4.2. Hoạt độ β-galactosidase của vi khuẩn
Từ đồ thị 4.2 cho thấy: Trong 11 chủng được chọn hai chủng có hoạt độ enzyme nội bào cao nhất là SC3 (390,32 U/l), SC4 (361,30 U/l) và thấp nhất là chủng SPD2.3 (3,08 U/l).
Kết quả hoạt độ β-galactosidase nội bào của chủng lactic SC3 và SC4 cao hơn chủng vi khuẩn LactoBacillus acidophilus (344 U/l) của tác giả Milica C et al., (2015) khi tối ưu hóa sản xuất β-galactosidase từ vi khuẩn lactic. Vì vậy
chúng tôi chọn hai chủng SC3 và SC4 để thực hiện cho những nghiên cứu tiếp theo.
4.2. ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN NUÔI CẤY ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP β- GALACTOSIDASE NỘI BÀO CỦA VÀ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP β- GALACTOSIDASE NỘI BÀO CỦA HAI CHỦNG SC3 VÀ SC4
Để xác định chính xác thời gian sinh enzyme cao nhất của chủng SC3 và SC4, chúng tôi tiến hành nuôi lỏng ở nhiệt độ 37ºC. Từ thời điểm nuôi, cứ sau 3h tiến hành lấy mẫu để đo mật độ quang ở 600nm và đem phá vỡ tế bào sau đó xác định hoạt độ β-galactosidase nội bào theo phương pháp được mô tả ở mục 3.4.1.3. Kết quả được thể hiện ở hình 4.3. và 4.4.
0 50 100 150 200 250 300 350 400 H oạ t đ ộ en zy m e (U /l )
Enzyme nội bào (U/l) Enzyme ngoạibào (U/l)
Hình 4.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt độ β-galactosidase nội bào từ chủng vi khuẩn SC3
Kết quả hình 4.4 cho thấy chủng SC3 từ 0 – 6h vi khuẩn ở giai đoa ̣n thích nghi, lúc này sự tổng hợp enzyme ít, từ 6 đến 21h vi khuẩn ở pha log, phát triển với tốc độ nhanh, giai đoa ̣n từ 21 đến 30h thuộc pha cân bằng, mâ ̣t đô ̣ quang ở mức ổn đ°̣nh. Khả năng sinh tổng hợp β-galactosidase của chủng SC3 thể hiê ̣n tương đồng với mâ ̣t độ sinh khối. Ở giai đoạn thích nghi hoa ̣t đô ̣ β-galactosidase thu được ở mức thấp, khi mâ ̣t đô ̣ quang tăng dần thı̀ hoa ̣t đô ̣ β-galactosidase tăng theo, đến pha cân bằng hoa ̣t đô ̣ enzyme thu được cao nhất đa ̣t 389,58 U/l sau 24h nuôi và hoạt độ của enzyme duy trı̀ ở mức tương đối ổn đ°̣nh đến 27h, sau đó bắt đầu giảm. 0 50 100 150 200 250 300 350 400 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 0 6 9 12 15 18 21 24 27 30 Abs 600 nm Hoạt tính (U/l) U/l Abs 600 nm
Hình 4.4. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt độ β-galactosidase nội bào từ chủng vi khuẩn SC4
Khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp β-galactosidase của chủng SC4 thể hiê ̣n ở hình 4.5. Kết quả cho thấy lượng sinh khối và hoạt độ của enzyme bắt đầu tăng nhanh sau 9h nuôi cấy và đạt mức cân bằng sau khi nuôi 21h. Lúc này hoạt độ β-galactosidase của chủng SC4 đạt cực đại là 369,16 U/l. Mật độ vi khuẩn và hoạt độ enzyme tương đối ổn định đến 27h. Sau khoảng thời gian này vi khuẩn bắt đầu pha suy vong và giá trị OD mật độ quang của tế bào và hoạt tính enzyme bắt đầu giảm.
Nghiên cứu này cho kết quả 24h là thời điểm thu nhận enzyme tối ưu. Kết quả này sớm hơn so với nghiên cứu của Milica et al. (2015) khi tối ưu hóa sản xuất β-galactosidase từ vi khuẩn lactic đã chỉ ra rằng thời điểm thu nhận β- galactosidase từ vi khuẩn LactoBacillus acidophilus tối ưu nhất sau 2 ngày. Vì vậy thời điểm 24h được sử dụng là thời điểm thu nhận enzyme từ chủng SC3 và SC4, enzyme thu nhận tại 24h sẽ sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
4.3. TUYỂN CHỌN VI KHUẨN SINH ENZYME CÓ HOẠT ĐỘ CAO Ở NHIỆT ĐỘ THẤP NHIỆT ĐỘ THẤP
Nhiệt độ có tác động mạnh mẽ tới khả năng hoạt động của enzyme, gây ảnh hưởng đến khả năng xúc tác của enzyme. Vì vậy chúng tôi tiến hành xác định hoạt độ của enzyme ở 4ºC và 30oC. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.2.
0 50 100 150 200 250 300 350 400 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 0 6 9 12 15 18 21 24 27 30 Abs 600 nm Hoạt tính (U/l) U/l Abs 600 nm
Bảng 4.2. Hoạt độ enzyme nội bào của chủng SC3 và SC4 tại 30oC và 4oC Nhiệt độ
(oC)
Hoạt độ enzyme nội bào (U/l) Tỷ lệ (%) so với hoạt độ ở 30oC
SC3 SC4 SC3 SC4
30 391,36 ± 7,27 369,40 ± 7,34 100 100
4 95,34 ± 2,21 41,02 ± 1,18 24,36 11,10
Nếu coi hoạt độ ở nhiệt độ 30ºC là 100% thì ở 4ºC hoạt độ enzyme của chủng SC3 cao hơn SC4 tương ứng là: 24,36% và 11,10%.
So sánh với các kết quả nghiên cứu trước đây của Selvarajan et al., (2015)
khi nghiên cứu động học của β galactosidase từ LactoBacillus plantarum HF571129 cho kết quả hoạt độ β-galactosidase ở 50oC là 100% và giảm còn 37% ở 20oC. Tương tự kết quả của Nguyễn Thị Vân Linh và cs. (2013) khi thực hiện thu nhận và tinh sạch β-galactosidase từ LactoBacillus acidophilus cũng thấy
rằng tại 40oC hoạt độ đạt 100% và giảm còn 55% ở 30oC. Kết quả khác của Omar
et al., (2016) khi nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ β-
galactosidase từ Artemisia judaica cho kết quả hoạt độ ở 20oC là 40% và giảm 23 % so với hoạt độ tại 30oC. Trong khi khảo sát chủng SC3 tại nhiệt độ 4ºC vẫn giữ được 24,36% hoạt độ so với 30ºC. Chủng SC3 có hoạt độ cao hơn so với chủng SC4 tại 4oC nên chúng tôi sử dụng chủng SC3 cho các nghiên cứu tiếp theo.
4.4. TINH SẠCH SƠ BỘ β - GALACTOSIDASE
Enzyme thường có rất nhiều protein ngoại lai gây cản trở các hoạt động của enzyme, vì thế để tăng hiệu suất xúc tác của enzyme chúng tôi tiến hành tinh sạch sơ bộ enzyme bằng phương pháp kết tủa muối amonisunfate ở các nồng độ muối khác nhau. Dịch nội bào ban đầu và dịch enzyme đã tinh sạch sơ bộ của chủng SC3 được xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford, hàm lượng protein trong mẫu được tính theo phương trình đường chuẩn protein. Hoạt độ β-galactosidase xác định bằng phương pháp như mục 3.4.1.3. Dựa vào hàm lượng protein và hoạt độ enzyme tính được hiệu suất thu hồi cao nhất của nồng độ muối. Kết quả thu được trong bảng 4.3.
Bảng 4.3. Bảng kết quả thu nhận β-galactosidase bằng muối amonisunfate từ chủng SC3 Nồng độ muối Thể tích (ml) Tổng hoạt tính (U) Tổng protein (mg) Hoạt tính riêng (U/mg protein) Hiệu suất thu hồi (%) Trước tinh sạch 600 36,94 101,8 0,363 100,00 40% 100 9,30 4,10 2,268 25,18 50% 100 25,30 11,20 2,259 68,49 60% 100 32,00 11,50 2,783 86,63 70% 100 32,00 15,70 2,038 86,63
Dựa vào hoạt tính riêng của β-galactosidase để xác định khả năng kết tủa β-galactosidase của (NH4)2SO4. Hoạt tính riêng càng cao chứng tỏ khả năng kết tủa (NH4)2SO4 càng tốt, độ sạch của enzyme càng cao. Qua khảo sát kết quả của 100ml enzyme với nồng độ muối (NH4)2SO4 khác nhau, chúng tôi nhận thấy ở nồng độ muối bão hòa 60% và 70% cho hiệu suất thu hồi cao nhất là 86,63%. Tuy nhiên hoạt tính riêng của enzyme khi tinh sạch sơ bộ bằng muối (NH4)2SO4
bão hòa 60% cao hơn 70% cụ thể là 2,783 (U/mg) và 2,038 (U/mg) so với trước tinh sạch sơ bộ là 0,363 U/mg. Kết quả này tương đồng với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Hải Yến (2003) khi khảo sát đặc tính và khả năng thu nhận enzyme β- galactosidaza từ vi khuẩn Sphingomonas paucimobilis BK16 đã chỉ ra rằng nồng độ muối amonisunphat bão hòa thích hợp nhất là 60%. Nghiên cứu của Duman YA, Kaya (2013) cũng chỉ ra rằng thu nhận β-galactosidase bằng (NH4)2SO4 bão hòa 60% cho hiệu suất thu hồi cao nhất. Vì vậy chúng tôi sử dụng enzyme đã thu nhận ở nồng độ muối bão hòa 60% của chủng SC3 để thực hiện cho nghiên cứu tiếp theo.
4.5. ĐẶC TÍNH CỦA β-GALACTOSIDASE TỪ CHỦNG SC3 SAU KHI TINH SẠCH SƠ BỘ SẠCH SƠ BỘ
4.5.1. Độ bền của β-galactosidase ở 4oC
Để xác định độ bền ở 4oC của β-galactosidase ở điều kiện pH 6,5, enzyme từ chủng SC3 được ủ ở nhiệt độ 4ºC. Ở các thời gian ủ khác nhau, enzyme được lấy ra để xác định hoạt độ, hoạt độ của enzyme sau khi ủ được xác định bằng
cách so sánh % hoạt độ còn lại của enzyme với thời điểm bắt đầu ủ. Kết quả xác định độ bền ở 4ºC của β-galactosidase nội bào được thể hiện ở hình 4.6.
Hình 4.5. Hoạt tính β – galactosidase ở 4ºC sau 24 ngày
Kết quả ở hình 4.6 cho thấy: Sau 24 ngày bảo quản enzyme ở 4ºC (512 giờ), hoạt độ của enzyme lại là (56,15%) so với thời điểm bắt đầu ủ (100% tại 0 giờ). Hoạt độ của enzyme giảm mạnh trong 6 ngày đầu (100% xuống còn 82,63%), 10 ngày tiếp theo hoạt độ của enzyme giảm chậm hơn (82,63% xuống còn 65,61%), từ ngày 18 đến ngày 24 hoạt độ của enzyme khá ổn định (từ 63,25% xuống còn 56,15%). Từ kết quả trên có thể kết luận chủng vi khuẩn SC3 có khả năng sinh β-galactosidase bền ở 4ºC trong 24 ngày. Kết quả của Selvarajan
et al., (2015) khi nghiên cứu động học của β galactosidase từ Lactobacillus plantarum HF571129 chỉ ra rằng khi bảo quản β-galactosidase ở 4oC trong 7h hoạt độ của nó giảm 25%. Một nghiên cứu khác của của Chen et al., (2009) cũng chỉ ra β-galactosidase từ Bacillus stearothermophilus giảm 31 % khi bảo quản ở
4ºC trong 6 tuần.
4.5.2. Khả năng phân giải lactose trong sữa của β-galactosidase ở 4ºC
Để xác định khả năng phân giải lactose của β-galactosidase đã tinh sạch sơ bộ từ chủng SC3 trong sữa tươi nguyên liệu ở nhiệt độ bảo quản (4ºC), chúng tôi sử dụng hệ thống HPLC với đầu dò RID. Coi nồng độ lactose ban đầu là 100%. Kết quả phân tích được thể hiện ở hình 4.7.
0 20 40 60 80 100 120 1 2 3 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 H oạ t đ ộ tư ơn g đ ối c ủ a en zy m e (% )
Hình 4.6. Khả năng phân giải lactose của β-galactosidase đã tinh sạch sơ bộ từ chủng SC3
Từ đồ thị cho thấy phần trăm lactose giảm qua từng giờ ở cả 3 công thức và công thức 2, công thức 3 có khả năng phân giải lactose nhiều hơn công thức 1 ở hầu hết các thời điểm. Tại 3h lượng lactose trong công thức 1, 2, 3 lần lượt là (77,36a %; 74,74b %; 73,89b %), tại thời điểm 12h là (61,54a %, 60,41ab %, 59,14b
%) và tại 27h là (45,27a %, 40,67b %, 39,89b %).
Khi xem xét kết quả nghiên cứu cho thấy công thức 2 và công thức 3 không có sự khác nhau về khả năng phân giải lactose ở các thời điểm với mức ý nghĩa α = 5%, vì vậy nên sử dụng công thức 2 (2,110 U/1 g lactose) là thích hợp hơn công thức 3. Tuy nhiên khả năng thủy phân lactose trong sữa tươi ở cả hai công thức là không triệt để sau 27h. Do hoạt tính sử dụng/1g lactose thấp hơn nhiều so với nghiên cứu của SH Choi et al., (2007) khi bổ sung 18ml β-
galactosidase (5000 U/g) vào 60 l sữa tươi, ủ ở 4oC trong 24 giờ giúp thủy phân 91% lactose.
Do vậy để có thể phân giải hết lượng lactose trong sữa cần sử dụng enzyme có hoạt lực cao hơn thông qua các công đoạn cô đặc enzyme hoặc với lượng sinh khối sử dụng lớn hơn. Việc sử dụng lượng dịch enzyme thấp/hoạt lực cao giúp giảm ảnh hưởng tới mùi vị của sữa.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 CT1 CT2 CT3 L ư ợ n g la ct os e cò n lạ i (% )
4.6. ĐỊNH DANH CHỦNG SC3 BẰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN 16 rDNA TRÌNH TỰ GEN 16 rDNA
Kết quả định tính, định lượng và kiểm tra các đặc tính của enzyme cho thấy vi khuẩn lactic SC3 có khả năng sinh β-galactosidase cao và bền ở 4ºC. Vì vậy, chúng tôi tiến hành xác định danh tính của vi khuẩn này bằng phương pháp phân tích sinh học phân tử.
Kết quả tách chiết DNA tổng số
SC3 M
Hình 4.7. Kết quả tách chiết DNA tổng số
Chú thích: M (marker): Thang DNA chuẩn 100 bp (Fermentas)
M SC3
Hình 4.8. Kết quả PCR với mồi 16 rDNA của vi khuẩn SC3
Chú thích: M (marker): Thang DNA chuẩn 100 bp (Fermentas)
DNA tổng số
Sản phẩm PCR được tinh sạch và xác định trình tự tại hãng First-base, Malaysia (hình 4.8 và hình 4.9)
Kết quả giải trình tự được so sánh với dữ liệu trên ngân hàng gene NCBI dùng công cụ blast (hình 4.10).
Hình 4.9. Kết quả so sánh trı̀nh tự tương đồng của SC3 theo mồi 16 rDNA bằng công cụ Blast
Kết luận: chủng SC3 là Streptococcus thermophilus và được đặt tên là
Streptococcus thermophilus SC3.
4.7. BƯỚC ĐẦU ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH SẢN XUẤT SỮA TƯƠI TIỆT TRÙNG KHÔNG LACTOSE
Từ kết quả nghiên cứu trên cho thấy: Vi khuẩn Streptococcus thermophilus SC3 có khả năng sinh β-galactosidase có hoạt độ cao và bền ở nhiệt
độ 4oC. Β-galactosidase từ chủng SC3 sau khi tinh sạch sơ bộ có khả năng phân giải đường lactose trong sữa tươi ở nhiệt độ thấp.
Trên thế giới, hiện tại Valio đang sản xuất sản phẩm sữa không lactose bằng công nghệ màng lọc với việc kết hợp sử dụng bốn loại màng liên tiếp, mỗi loại trong số đó phục vụ một mục đích khác nhau. Theo khả năng phân tách từ loại có kích thước lỗ nhỏ nhất đến kích thước lỗ lớn nhất bao gồm: màng thẩm thấu ngược (RO), màng lọc nano (NF), màng siêu lọc (UF) và màng vi lọc (MF). Việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật màng giúp loại bỏ được đường lactose
mà vẫn giữ nguyên được các thành phần khác trong sữa (Tossavainen et al.,
2013). Tuy nhiên công nghệ này đòi hỏi chi phí đầu tư lớn và công nghệ hiện đại hơn rất nhiều so với việc sử dụng enzyme để loại bỏ lactose khỏi sữa.
Từ các kết quả trên chúng tôi đề xuất sử dụng β-galactosidase nội bào từ vi khuẩn Streptococcus thermophilus SC3 để ứng dụng trong quy trình sản xuất sữa tiệt trùng ít lactose hoặc không lactose với quy trình và nội dung như sau