3.4.4.1. Phương pháp tinh sạch sơ bộ enzyme bằng muối amonisunfate
Dịch enzyme thô sau khi tách còn chứa nhiều tạp chất. Để loại bỏ tạp chất người ta thường sử dụng phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối amonsunfate. Phương pháp tinh sạch được tiến hành theo Wendry Setiyadi Putranto (2007) mô tả như sau:
Tiến hành tinh sạch sơ bộ β-galactosidase bằng cách cho từ từ (NH4)2SO4 tới độ bão hòa 40%, 50%, 60% và 70% vào dịch enzyme thô, khuấy cho tan hết, để cho kết tủa ở 4oC qua đêm. Sau đó ly tâm tách phần tủa ở 10000 vòng/phút, 4oC trong 10 phút. Phần tủa được hòa tan bởi đệm phosphate pH=6.5. Sau đó được xác định hoạt độ enzyme như mô tả ở mục 3.4.1.3 và tiến hành định lượng protein trong enzyme trước và sau tinh sạch bằng phương pháp Bradford (1976).
3.4.4.2. Phương pháp định lượng protein tổng số bằng phương pháp Bradford
Phương pháp xác định protein tổng số theo Bradford, 1976 được mô tả như sau:
Nguyên tắc:
Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein. Trong dung dịch mang tính acid khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm ở dạng màu đỏ có bước sóng hấp thu cực đại là 465 nm khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm chuyển sang dạng màu xanh dương và hấp thu cực đại ở bước sóng 595 nm.
Tiến hành:
Bước 1: Dựng đường chuẩn protein
Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với dung dịch protein chuẩn đã biết trước nồng độ. Dung dịch protein chuẩn được sử dụng là bovine serum albumin (BSA). Sau khi cho dung dịch protein vào thuốc nhuộm màu, màu sẽ xuất hiện trong 2 phút và bền tới 1 giờ.
Bảng 3.6. Pha dãy đường chuẩn protein
Ống nghiệm 1 2 3 4 5
BSA ( 1mg/ml)(µl) 80 60 40 20 10
Nước cất (µl) 20 40 60 80 90
Hút từ mỗi ống nghiệm 25µl dịch protein chuẩn vào các ống nghiệm khác có chứa sẵn 1000µl thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue, lắc đều bằng máy lắc vontex, để yên 20 phút trong bóng tối. Sau 20 phút, tiến hành đo dung dịch bằng máy đo quang phổ kế ở bước sóng 595 nm ta được các giá trị OD, độ hấp thu sẽ tỷ lệ với lượng protein trong mẫu.
Vẽ đường tuyến tính giữa nồng độ protein (mg/ml) với mật độ quang Abs595 ta được phương trình tuyến tính y = ax + b. Dựa vào phương trình để tính được lượng protein có trong mẫu thí nghiệm.
Kết quả: Đường chuẩn có phương trình y = 0.3161x + 0.0387, trong đó x giá trị BSA (mg/ml), y là giá trị OD ở bước sóng 595 nm (hình 3.2).
Hình 3.2. Đường chuẩn protein
Bước 2: Xác định lượng protein tổng số
Các mẫu thí nghiệm được làm tương tự, thay 25µl mẫu protein chuẩn bằng 25µl mẫu thí nghiệm. Lượng protein trong mẫu được tính dựa vào phương trình đường chuẩn protein:
x = <=> ?
Trong đó:
x: là lượng protein trong mẫu (mg) y: là OD595 đo được của mẫu.
y = 0.3161x + 0.0387 R² = 0.9953 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 A bs 5 95 nm BSA (mg/ml) OD tb Linear (OD tb)